文献解读|单分散铜(I)基纳米MOF作为可生物降解的药物载体增强光动力治疗效果

研究背景

    如今，人类正遭受着严重的癌症发病，而且发病率还在不断增加。目前，治疗肿瘤的主要方法有手术，化疗，放疗(RT)，基因治疗(GT)，光动力疗法（PDT），光热疗法(PTT)、免疫疗法或多模式协同癌症治疗。PDT是一种美国FDA批准的新兴疗法，PDT在光激活下通过光敏剂(PS)产生活性氧(ROS)，产生细胞毒性杀死癌细胞，具有微创和良好疗效的优点。基于不同的光化学机理，PDT分为两类：I型PDT和II型PDT。I型和II型PDT均涉及PS的活化从基单线态到激发单线态，然后到电子激发三线态。对于报道最多的II型PDT过程，激发三线态可以将三线态氧(3O2)转化为细胞毒性单线态氧(1O2)。然而，由于肿瘤组织的快速繁殖，对氧气（O2）的需求远远超过了O2的供应，从而导致血管系统的异常生长，从而阻碍O2的扩散并导致缺氧的恶性循环。因此，缺氧最初普遍存在于实体瘤中。不幸的是，II型PDT系统高度依赖于O2浓度并涉及O2的急剧消耗，这加重细胞内缺氧，反过来抑制PDT的治疗效果。

    为了解决这个问题，O2自供方法被广泛用于提高肿瘤中O2的浓度。一种直接的方法是利用全氟化碳和金属有机框架(MOF)等O2存储材料将O2输送到肿瘤细胞中。另一种通用策略是通过催化原位产生O2以缓解缺氧。报道的催化剂包括过氧化氢酶、MnO2、铂（IV）二叠氮配合物、Pt纳米酶、MnFe2O4、氮化碳等。然而，由于恶性肿瘤存在严重缺氧，补充O2对II型PDT的效果仍然较差。与II类方法不同，I类反应由PS和底物通过氢或电子转移过程直接激活的反应组成，通常产生羟基自由基(?OH)或超氧自由基(O2?)。到目前为止，一些纳米结构包括ENBS-B、LiYF4@SiO2@ZnO、TiO2-钌、Ce-UCNPs、金-铜硫化物蛋黄壳纳米粒子、环金属化Ru(II)配合物和Ti-TBP MOF常被应用，表明I型PDT在缺氧条件下非常有效。此外，缺氧尤其有害，不仅能显著增加对II型PDT等疗法的抵抗力，还能引发致癌转化，给癌症治疗带来很大困难。近期研究表明肿瘤缺氧可降低10-11易位活性从而导致DNA高甲基化，而高甲基化经常抑制肿瘤抑制基因的表达，从而促进肿瘤进展。另一份报告表明，缺氧会促进缺氧诱导因子(HIF)的稳定表达，在缺氧癌细胞中产生的HIF蛋白被认为会加速肿瘤发生。因此，克服缺氧是癌症治疗中非常关键的问题。另一个关键问题是谷胱甘肽(GSH)的过度表达在肿瘤中广泛存在，过量的GSH会显著降低在癌症治疗过程中ROS的细胞毒性，从而降低PDT的疗效。迄今为止，解决这个问题的通用策略包括使用纳米材料进行细胞内氧化反应以降低细胞内GSH水平。

    作为一种新兴的多孔材料，MOFs被广泛应用。尤其是具有特征成分的杂化材料易于功能化，是治疗癌症的候选材料。最近，Tang等人报道了使用以CuII为活性中心的Cu(II)基卟啉MOF吸附细胞内GSH以增强PDT。然而，研究人员并未考虑缺氧对PDT的严重阻碍。此外，CuII位点与巯基的结合能力不如CuI强。受这一观察的启发，该研究设计了一种生物相容性和可生物降解的载氧CuTz-1@F127（表示为CuTz-1-O2@F127）MOF治疗系统，通过同步缓解细胞内缺氧和降低肿瘤中的GSH水平来增强PDT。值得注意的是，此前并没有同时克服缺氧和降低细胞内GSH的报道。首先，CuTz-1 MOF可以作为光活化光敏剂(PS)，即在过氧化氢(H2O2)存在下产生羟基自由基(?OH)和O2，即I型PDT，如方案1所示。此外，CuTz-1@F127可以携带O2分子进入癌细胞并吸附细胞内GSH，同时缓解缺氧和GSH过表达，可以大大提高PDT的疗效。外部F127可以增强CuTz-1-O2的生物相容性。尾静脉（i.v.）注射后，CuTz-1-O2@F127由于增强的渗透性和EPR效应可以在肿瘤中积累，并且NPs在NIR照射下通过协同作用显示出较高的抗肿瘤功效。此外，CuTz-1-O2@F127制备简单，避免了一些复杂的程序，赋予了单一MOF材料的多功能性。更重要的是，CuTz-1-O2@F127 NPs具有高度的生物相容性和生物降解性。生物分布和代谢实验表明，早期CuTz-1-O2@F127 NPs主要在肝脏和脾脏中积累，然后随着CuTz-1-O2@F127 NPs的降解，通过粪便和尿液排出体外。一个月后，共有近90%的纳米颗粒可以通过粪便和尿液排出体外，这对于纳米医学的潜在临床应用具有重要意义。

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方案1

基本信息

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题目：Monodispersed Copper(I)-Based Nano Metal–Organic Framework as a Biodegradable Drug Carrier with Enhanced Photodynamic Therapy Efficacy

期刊：ADVANCED SCIENCE

影响因子：16.806

PMID：31406677

通讯作者：逄茂林和林君

作者单位：中科院长春应化所

索莱宝合作产品：

产品名称  Reduced glutathione (GSH) assay kit

产品货号  BC1170

摘 要

光动力疗法(PDT)已经成为治疗癌症的一种有效方法。然而，PDT的治疗效果受到肿瘤中氧气（O₂）供应不足和谷胱甘肽（GSH）过度表达的微环境的严重限制。在此，本团队提出了一种可生物降解的负载O₂的CuTz-1@F127金属有机框架（MOF）治疗平台（表示为CuTz-1-O₂@F127），可通过克服细胞内缺氧并降低肿瘤中的谷胱甘肽水平用于增强PDT。这种基于Cu(I)的MOF在近红外光照射和有H₂O₂存在的情况下能够发生类芬顿反应生成?OH和O₂。同时，CuTz-1-O₂@F127纳米颗粒（NPs）可以释放吸附的O₂，进一步缓解细胞内缺氧。此外，CuTz-1@F127中的Cu(I)可以与细胞内的GSH反应，减少过量的GSH。这样，PDT的效率大大提高。尾静脉注射后，纳米颗粒通过在808nm激光照射下具有很好的协同抗肿瘤效果。更重要的是，NPs是可生物降解的，体内生物分布和代谢实验表明，近90%的NPs纳米材料可在30天内通过粪便和尿液排出，具有很好的临床转化前景。

研究内容及结果

1.CuTz-1@F127的合成与表征

据报道，CuTz-1可以表现出类似半导体的行为，并且能够在H₂O₂存在下在氙灯照射下发生类芬顿反应生成?OH。图1a表明，在涂覆F127前后，CuTz-1的形态变化不大。粉末X射线衍射(PXRD)分析(图1b)证实了纳米颗粒的结构。傅里叶变换红外光谱(FTIR)（图S3）和热重分析（TGA）（图S4）结果证明F127涂层成功。TGA曲线显示在CuTz-1上有大约10 wt%的F127涂层。此外，分别测量了悬浮在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中的CuTz-1和CuTz-1@F127的zeta电位、流体动力学大小和多分散指数。如图1c、d和图S5所示，涂覆F127后，平均zeta电位值从-5.6±0.3变为-1.2±0.1mV，动态光散射（DLS）数据显示平均流体动力学尺寸从170.1±11.5增加到186.4±16.7nm，多分散指数从0.27±0.03降低到0.14±0.03，表明CuTz-1@F127颗粒在生理环境中的溶解度和分散性增强。

图1

2.检测羟基自由基

?OH的产生首先通过检测3'-(对氨基苯基)荧光素的荧光增强(APF)，3'-(对氨基苯基)可以选择性地与?OH反应并变成高荧光。如图S7所示，在808nm激光照射下，在CuTz-1@F127 PBS溶液中，H₂O₂存在下观察到APF荧光明显增强。接下来，观察到CuTz-1@F127在激光照射下在H₂O₂存在的情况下有效降解RhB（图2a）。而且，DCFH-DA被用于监测细胞内ROS，由于DCFH-DA可以被细胞内的酯酶水解成DCFH，然后非荧光DCFH可以被?OH氧化成绿色荧光的二氯荧光素(DCF)。图S8表明CuTz-1@F127用808nm激光(0.6 W cm^?2)照射10分钟，细胞内ROS的产生，绿色荧光表明在激光照射下进一步产生了?OH。

3.谷胱甘肽还原的体外研究

考虑到癌细胞中过量的谷胱甘肽会减弱PDT的有效性。该团队继续研究CuTz-1@F127是否能降低细胞内GSH。首先，在GSH存在下，CuTz-1@F127保持完整（图S9）。然后，使用GSH检测试剂盒测定保留在上清液中的GSH含量。如图2b所示，虽然GSH分子尺寸大于CuTz-1的孔径，但CuTz-1@F127在水溶液中与GSH混合后，CuTz-1@F127的BET表面积从184.5 m²g^-1下降到 132.7 m²g^-1。该小幅下降表明GSH分子与Cu^I位点结合并占据部分CuTz-1@F127的微孔。元素映射结果（图2d和图S11）确认硫元素均匀分布在基体中，进一步证明了CuTz-1@F127可以吸附GSH。此外，为了验证GSH对?OH氧化能力的影响，在RhB的降解实验中加入GSH，并引入TiO₂（光催化剂）进行比较，如图2a所示，CuTz-1@F127和TiO₂在808nm和氙灯激光照射下对RhB显示出优异的降解效率。然而，当添加GSH时，TiO₂的降解能力严重减弱，CuTz-1@F127仍然可以降解近70%的RhB。这个结果表明CuTz-1@F127能有效降低GSH并保持?OH的杀伤力。

图2

4.氧气产生的体外研究

值得注意的是，MOFs是O₂存储的良好候选者。该团队测试了CuTz-1@F127的O₂吸附能力。氧吸附-解吸等温线（图2e）显示CuTz-1@F127可以吸附标准大气压和室温下高达400μmol g^?1的O₂。浸入O₂后，得到CuTz-1-O₂@F127（图1a）。为了证明CuTz-1-O₂@F127的O₂产生和释放性能，我们测量了808nm激光照射下的O₂浓度。如图2f所示，在低H₂O₂浓度下，CuTz-1@F127 PBS溶液中观察到O₂浓度增加，表明在类芬顿反应过程中产生了O₂。由于在近红外光辐射刺激下Cu^I向Cu^II转化过程中会产生电子和空穴，可能导致CuTz-1-O₂@F127可以释放癌细胞内吸附的O₂，进一步缓解细胞内缺氧。最终，产生和释放的O₂都可以克服细胞内缺氧，这在PDT中起着辅助作用。

5.细胞研究：细胞摄取、生物相容性和光细胞毒性

进一步进行体外实验研究CuTz-1-O₂@F127的抗肿瘤功效。首先，倒置荧光显微镜图像显示纳米颗粒可能是在4小时内被4T1细胞（小鼠乳腺癌细胞）内吞（图S12）。然后，L929细胞（小鼠成纤维细胞）、HeLa细胞和4T1细胞用MTT细胞活力实验来检测生物安全性。如图3a所示，虽然CuTz-1-O₂@F127的浓度为高达200×10^?6 M，L929细胞的活力在孵育24小时后仍然接近100%，表明CuTz-1-O₂@F127对正常细胞具有高度生物相容性。当CuTz-1-O₂@F127的浓度超过100×10^?6 M时，HeLa和4T1癌细胞的活性降低。这是因为CuTz-1-O₂@F127可以吸附细胞内的GSH，并且GSH的减少影响癌细胞的正常生长，导致癌细胞和正常细胞活力的差异。接下来，CuTz-1@F127和CuTz-1-O₂@F127与4T1细胞一起孵育，在缺氧和常氧条件下，检测PDT效果。CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O₂@F127+光处理后，与4T1细胞孵育24小时，MTT法检测细胞活力。如图3b所示，缺氧处理组在光照下表现出比常氧细胞更高的细胞存活率。该结果表明细胞内缺氧促进癌细胞增殖，进一步说明了肿瘤治疗过程中克服缺氧的重要性。正如预期的那样，CuTz-1-O₂@F127+光处理组在缺氧条件下的治疗效果与常氧条件下相似，并且治疗效果随着CuTz-1-O₂@F127浓度的增加而增加。流式细胞术分析（图S13）进一步证明了CuTz-1-O₂@F127+光处理组显示出低的肿瘤细胞存活百分比（约21.1%）。

图3

6.ROS和缺氧的细胞内检测

使用ROS-ID缺氧/氧化应激检测试剂盒来研究细胞内ROS和缺氧。如图3c所示，对照组在没有光照的情况下没有产生活性氧；然而，在缺氧和常氧条件下，808nm激光照射组均检测到强ROS信号，表明I型PDT过程即使在缺氧条件下也能产生大量的?OH。此外，近红外光照射后，CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O₂@F127+光组在缺氧条件下处理的细胞显示比未照射的红色荧光弱，表明CuTz-1@F127在NIR照射下可以在细胞中产生O₂，CuTz-1-O₂@F127+光组显示出比CuTz-1@F127+光组更弱的红色荧光，表明CuTz-1-O₂@F127可以进一步释放它携带的O₂以缓解癌细胞的缺氧。

图3

7.活/死细胞染色分析

为了进一步检查CuTz-1 MOF系统在缺氧条件下的细胞光毒性，通过Calcein-AM/PI双染试剂盒区分活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。如图3d所示，作为对照组，所有未经处理或用PBS+光、CuTz-1@F127和CuTz-1-O₂@F127处理的细胞，细胞均显示绿色荧光，表明细胞几乎没有损伤。在808nm激光照射下，CuTz-1@F127处理组观察到细胞显示很微弱的绿色荧光，表明大多数细胞死亡。用CuTz-1-O₂@F127+光处理组观察到细胞显示红色荧光，表明细胞均死亡。这些结果进一步表明CuTz-1-O₂@F127在克服缺氧以增强癌细胞的PDT方面具有优越的治疗效果。

8.体内肿瘤抑制能力

随着PDT效应在体外被广泛研究和认可，进一步研究了CuTz-1-O₂@F127在4T1荷瘤小鼠上体内的治疗效果。实验设计了六组带有4T1肿瘤的雌性Balb/c小鼠（n=5），分别通过尾静脉注射方法对其进行治疗。每只按照20mg/kg的剂量注射，对照组为PBS，实验组为PBS+光、CuTz-1@F127、CuTz-1@F127+光、CuTz-1-O₂@F127和CuTz-1-O₂@F127+光。每2天测量体重和肿瘤大小。图4a显示各组小鼠的体重随着时间的推移逐渐增加，表明这些操作对小鼠的副作用很小。图4b显示了随着时间的推移对肿瘤的治疗效果。与对照组相比，CuTz-1@F127和CuTz-1-O₂@F127治疗组均表现出一定的抑瘤作用。这是因为CuTz-1@F127可以降低肿瘤中GSH的水平（图4c），从而影响癌细胞的正常生长。CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O₂@F127+光治疗组的肿瘤被有效抑制。此外，由于更多的O₂补充，CuTz-1-O₂@F127+光组表现出好的肿瘤抑制效果。上述结果表明，载氧MOF治疗系统在808nm激光照射下可实现有效肿瘤抑制。治疗14d后，处死所有小鼠，切除肿瘤并称重。图4d和图S14显示，CuTz-1-O₂@F127+光组中的肿瘤生长明显受到抑制，可增强PDT疗效。对肿瘤组织进行原位苏木精和伊红(H&E)染色，如图4e所示，在CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O₂@F127+光组都可以观察到明显的肿瘤组织坏死，表明?OH的杀伤力。同时，CuTz-1-O₂@F127、CuTz-1@F127+光、CuTz-1-O₂@F127+光各处理组和对照组的肝、脾、肺、肾、心脏等主要器官的H&E染色图像显示没有发现明显的组织损伤（图S15）。正如预期的那样，表明CuTz-1-O₂@F127具有良好的生物安全性。

图4

9.体内长期毒性、生物分布和代谢研究

CuTz-1-O₂@F127的长期毒性和体内生物分布是通过对Balb/c小鼠进行静脉注射NPs实现的。如表S1所示，血清生化数据显示治疗组与对照组之间没有主要参数差异，包括心功能的肌酸激酶（CK）；肾功能的血尿素(BUN)和血清肌酐(CRE)；肝功能的谷丙转氨酶（ALT），天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)。为了确定体内CuTz-1-O₂@F127 NPs的生物分布，在尾静脉注射后定期收集所有小鼠的肿瘤和主要器官。铜浓度用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)进行检测。如图5a所示，在静脉注射后的前12小时内，注射的NPs主要被肝脏和脾脏吸收。因为EPR效应，大量NPs可在肿瘤部位蓄积，24h左右达到最大值。然后随着时间的延长，被检测器官中的NPs减少。进一步研究了小鼠中NPs的代谢情况，有趣的是，如图S16和S17所示，SEM和PXRD数据显示CuTz-1-O₂@F127在第五天开始分解。在第10天，CuTz-1-O₂@F127完全失去了其形态和晶体结构。因此，进一步测量了注射CuTz-1-O₂@F127的小鼠在不同时间点收集的粪便和尿液中Cu含量。在早期，肝脏中积累的NPs主要通过胆汁排泄到粪便中，一周后，降解后的NPs可通过肾脏排出，形成尿液（图5b）。第14天，NPs随尿液排出达到最大值。此后，排出量逐渐减少，30d后，NPs通过粪便和尿液以90%的高比率排出。这个现象表明虽然CuTz-1在GSH水溶液中稳定，但由于其复杂的TME和可生物降解性，可以排出体外，这极大地证明了CuTz-1-O₂@F127的生物降解性。

图5

结 论

总之，我们开发了用于增强癌症PDT疗效的CuTz-1-O₂@F127治疗平台。这种纳米级MOF治疗剂的制造简单明了。该研究证明了使用CuTz-1-O₂@F127作为潜在的PDT试剂，它具有出色的产生?OH和克服细胞内缺氧的能力，以及降低细胞内GSH水平的能力。尽管对I型PDT机制的阐述，尤其是O₂是否起作用，仍有争议。但体外和体内实验表明，克服缺氧可以增强PDT疗效。更重要的是，一个月后CuTz-1-O₂@F127可以通过粪便和尿液以90%的高比率排出小鼠体外，这对于纳米医学在临床应用方面具有潜在的意义。

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