文献解读|基于内源性核糖体重组蛋白的mRNA可吸入纳米制剂用于逆转博莱霉素诱导的小鼠模型肺纤维化

研究背景

特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性且最终致命的呼吸系统疾病，在全球范围内影响超过500万人。IPF是一种由肺泡上皮细胞（AEC）异常引发的疾病，异常活化的肺上皮细胞可以产生使成纤维细胞迁移、增殖和分化为活性肌成纤维细胞的介质。异常的成纤维细胞病灶分泌过量的细胞外基质（ECM），主要为胶原蛋白，导致肺组织纤维过度瘢痕化，肺泡结构破坏。因此，肺内ECM的局部清除和纤维化肺泡的上皮再生对于逆转这种疾病的进展至关重要。然而，目前针对IPF的临床药物治疗仅仅是减缓了疾病的进展和肺功能的恶化，却无法恢复纤维化肺泡的功能，只能带来一定的缓解。在某些情况下，一些药物甚至会产生副作用。IPF的有效治疗策略尚不明确，但刻不容缓。

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类由多种蛋白水解酶组成的酶。其中，MMP13在ECM成分的降解中扮演重要角色。在纤维化肺组织中，尽管MMP13的表达增加，但由于肺内ECM的大量产生和胶原溶解不平衡，随着IPF进展ECM沉积不断增加，导致肺纤维化程度加重。在纤维化病灶中，增加MMP13可加速ECM降解，恢复肺泡空间。此外，IPF的完全恢复还需要修复和再生受损的肺泡上皮细胞，以修复和重建完整的肺内气体交换空间，维持正常的肺功能。肺泡上皮细胞的修复需要干细胞，即Ⅱ型肺泡上皮细胞（AEC2s）。在IPF的发病过程中，部分AEC2s会出现上皮-间质转化、衰老、凋亡、甚至衰竭，角质细胞生长因子（KGF）是一种促进AEC2s有丝分裂的潜在因子，能诱导AEC2s增殖，抑制TGF-β1生成，提高表面活性蛋白分泌，有利于纤维化肺泡的上皮再生。因此作者推测MMP13和KGF联合治疗可加速肺内ECM的清除和重建被破坏的纤维化肺泡，从而逆转IPF的进展，改善肺功能。

本研究开发了一种可吸入的纳米递送系统，共载基质金属蛋白酶13 mRNA (mMMP13) 和角化细胞生长因子（KGF），传递到纤维化的肺组织中，从而逆转博莱霉素诱导的小鼠模型的肺纤维化。鱼精蛋白是一种阳离子核衍生蛋白，已被广泛用于基因传递的研究中，然而，鱼精蛋白与核酸之间的过度缩合反应，在一项癌症疫苗研究中表现出有限的转染效率。此外，由于其在人体内的异质性，存在交叉反应的潜在风险，限制了鱼精蛋白在临床中的应用。核糖体蛋白是一组与核糖体RNA（rRNAs）结合形成核糖体的内源性蛋白质，具有多种等电点（pIs）和分子量（MWs）的阳离子蛋白，可将异源交叉反应的风险降到 低，在生物医学领域中应用前景更广阔。此外，核糖体蛋白等电点的多样性赋予了其正电荷的灵活性，核酸可以以仿生的方式浓缩成纳米复合物。在本研究中，开发了一种具有不同理论等电点但分子量相近的多种核糖体蛋白。通过评估核糖体蛋白聚合的萤火虫荧光素酶(mFluc) mRNA的体外转染效率，筛选出最佳的核糖体重组蛋白用于递送mMMP13。以核糖体蛋白聚合的mMMP13为核心、双功能肽修饰的冠状层和具有聚乙二醇化的KGF外保护层组装成纳米颗粒。当通过喷雾器吸入时，被微滴携带的纳米制剂沉积在肺泡中，随后渗透到间质纤维化灶，外层KGF在MMP2触发后被原位释放，RGD基序嫁接的核心暴露并特异性靶向于富含整合素的肌成纤维细胞和受损的AEC2s中，用于mMMP13的细胞内传递。在肺纤维化小鼠模型中，吸入式纳米制剂治疗加速了大量胶原蛋白的降解和肺泡上皮再生过程，进而协同恢复肺泡完整性，改善肺功能。

基本信息

题目：Inhaled mRNA Nanoformulation with Biogenic Ribosomal Protein Reverses Established Pulmonary Fibrosis in a Bleomycin-Induced Murine Model

期刊：ADVANCED MATERIALS

影响因子：30.849

PMID: 35146813

通讯作者：姜新义

作者单位：山东大学药学院

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摘要

特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性的、最终可致命的呼吸系统疾病，可选择的有效治疗手段很少，由肺泡上皮细胞（AECs）的重复性微损伤引发，发展到细胞外基质（ECM）的大量沉积，最终导致纤维瘢痕化和肺泡结构的破坏。在本研究中，一种基于核糖体蛋白的mRNA吸入式纳米制剂被用于清除肺内ECM并使被破坏的肺泡上皮再生，从而逆转IPF中发生的纤维化灶。该纳米制剂由核糖体蛋白聚合的mRNA为核心、双功能肽修饰的冠状层和具有聚乙二醇化KGF的外保护层依次组装。当通过喷雾器吸入时，微滴携带的纳米制剂沉积在肺泡中，并穿透纤维化灶，在基质金属蛋白酶2（MMP2）被触发后，外层KGFs被原位释放，RGD基序嫁接的核心暴露，并特异性地靶向整合素升高的细胞，以便mRNA在细胞内传递。反复吸入纳米制剂可通过增加MMP13的表达和促进KGFs介导的肺泡上皮再生，从而加速局部胶原蛋白的清除，协同改善博莱霉素诱导的小鼠模型的肺功能。本研究提供了一种可吸入的mRNA纳米递送系统，具有治疗IPF的巨大潜力。

研究内容及结果

1.mMMP13递送蛋白的筛选

首先开发了具有不同等电点的阳离子核糖体蛋白（RP），在不同的重量比（RP：mFluc=1、2、4、8、16）下制备核糖体蛋白聚合的mFluc核（mFluc@RP）。靶向整合素的冠状层AA-PLL-PEG-c（RGDfK）是一种合成聚合物，具有pH响应型的电荷逆转能力，可促进mRNA的内含体逃逸。AA-PLL-PEG-c（RGDfK）被定义为P。通过静电相互作用制备了冠状层包裹的mFluc@RP纳米配合物（mFluc@RP/P）。通过测定mFluc@RP/Ps的形态学特征和转染率，最终选取核糖体蛋白L32（RPL32）作为递送mMMP13的最佳阳离子蛋白（图1）。

图1

接下来研究AA-PLL-PEG-peptide-PEG-N3（简称P-N3）和的mMMP13体外转录，优化了RPL32聚合的mMMP13纳米配合物（定义为mMMP13@RP）。该mRNA的封装效率为91.4±0.030%。随后，通过静电吸引和链接反应制备吸入式mRNA纳米制剂（定义为mMMP13@RP/P-KGF）。在透射电镜（TEM）下，amMMP13@RP/P-KGF呈直径约250nm的球形（图2b），这与流体动力学直径（261.6±2.558，251.2±5.093nm）一致（图2c）。在TEM图像中观察到pH7.4或pH5.5 MMP2预处理的amMMP13@RP/P-KGF的形态学变化（图2b），在pH7.4条件下，与MMP2孵育后，纳米制剂的外壳部分破坏，大部分球形纳米颗粒变成不规则形状。当pH值为5.5时，纳米颗粒周围出现明显松散的冠状层，说明在酸性条件下发生了电荷逆效应。此外，从mMMP13@RP（172.7±3.900nm）到mMMP13@RP/P/P-N3（228.3±3.265nm）和mMMP13@RP/P-KGF（261.6±2.558nm），粒径逐渐增大，粒子Zeta电位明显改变（图2c，d）。这表明P-N3和KGF的嫁接有效。为了进一步证实，用ELISA法测定了KGF的封装效率，发现约41.85%的KGF被嫁接到mMMP13@RP/P-KGF的表面。此外，测定了MMP2对amMMP13@RP/P-KGF的反应性，并通过ELISA法监测KGF的释放情况。在50×10^?9 _M MMP2孵育6h后，amMMP13@RP/P-KGF释放出超过50.1%的KGF，比无MMP2孵育组高21倍。在50×10^?9 _M MMP2孵育24h后，约67.2%的KGF被释放，证实了amMMP13@RP/P-KGF对MMP2的高敏感性（图2e）。amMMP13@RP/P-KGF的MMP2应答能力证实了KGF在纤维化灶中的特异性释放，从而在理论上减少了副作用。

图2

2.吸入式纳米制剂在胞内传递和胞质释放的表现

纤维化肺泡高度表达MMP2，可以有效引导KGF从纳米制剂中释放。作者比较了MMP2处理前后纳米制剂的细胞毒性（图3a），没有检测到被纳米制剂处理或者MMP2预处理的的体外AECs有任何显著的细胞毒性作用。随后，评估了mMMP13@RP/P-KGF促进肺泡上皮再生的能力，在图3b中，MMP2预处理的amMMP13@RP/P-KGF显著促进了AEC2s的增殖，表明mMMP13@RP/P-KGF在体内促进上皮再生方面有较大的潜力，进一步分析了mMMP13的体外细胞内的递送情况，通过TGF-β1刺激成纤维细胞诱导所得肌成纤维细胞的表型，用于后续分析，在IPF的细胞环境下，异常激活的肌成纤维细胞和受损的AEC2s（以A549细胞为代表），其整合素表达水平升高，在纤维化病灶中很明显，因此对IPF的进展至关重要。MMP2预处理的amMMP13@RP/P-KGF纳米制剂分别与成纤维细胞、肌成纤维细胞、AEC2s和A549细胞孵育6h，以验证在纤维化肺泡中，肌成纤维细胞和受损的AEC2s是否大量吸收纳米制剂，为了观察细胞摄取和胞内运输，mMMP13被红色荧光探针（Cy5）标记，并封装在纳米制剂中，结果显示肌成纤维细胞和A549细胞的胞质荧光信号强于成纤维细胞或AEC2细胞，这一结果表明了细胞整合素和RGD环肽之间的相互作用。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示，经MMP2预处理的amMMP13@RP/P-KGF处理肌成纤维细胞和A549细胞的红色荧光强度在6小时强于1或3小时（图3c），与未经MMP2预处理的amMMP13@RP/P-KGF孵育的细胞相比，经MMP2预处理的amMMP13@RP/P-KGF孵育的细胞荧光信号显著增强（图3d，h）。流式细胞术的结果进一步证实了这些发现（FCM；图3e、f、i、j）。此外，还研究了该纳米制剂的内含体逃逸过程，在amMMP13@RP/P-KGF（经MMP2预处理）处理的肌成纤维细胞中，随着孵育时间的延长，溶酶体（lysosome）绿色荧光与Cy5红色荧光的重叠逐渐减少，表明纳米制剂从内含体中成功逃逸（图3k）。吸入式纳米制剂在mRNA胞内传递和胞质释放显示出了生物医学应用的潜力。

图3

3.体外转染效率评价

为了在体外观察转染结果，本研究使用增强型绿色荧光蛋白mRNA（mEGFP）作为模型mRNA来构建类似的纳米制剂。研究了该纳米制剂保护mRNA免受核糖核酸酶降解的能力，经核糖核酸酶处理的amEGFP@RP/P-KGF组的转染效率与未经核糖核酸酶处理的amEGFP@RP/P-KGF对照组的转染效率相当，表明在核糖核酸酶存在下，纳米制剂可以保护mRNA。用脂质体3000（lipo3000）作为标准转染试剂，形成lipo3000聚合的mEGFP纳米制剂，并与RPL32聚合的mEGFP纳米制剂进行比较，在RPL32聚合的mEGFP纳米制剂组中，可以观察到更高的转染效率。此外，如图4a-d所示，在肌成纤维细胞或A549细胞中，MMP2预处理的amEGFP@RP/P-KGF组与amEGFP@RP/P-KGF组的荧光密度和GFP阳性率存在显著差异，进一步验证了MMP2对mMMP13@RP/P-KGF的响应特性。通过ELISA检测细胞培养上清液中的MMP13，评估其体外表达情况（图4e）。结果表明，与对照组相比，MMP13蛋白水平在24h后仍保持强烈上调（肌成纤维细胞增加了39倍，A549细胞增加了45倍）。

图4

4.mMMP13@RP/P-KGF的体内抗纤维化性能

在博莱霉素诱导的IPF小鼠模型中，探索了mMMP13@RP/P-KGF的生物分布。mFluc、mFluc@RP/P和mFluc@RP/P-KGF均被吸入，给药浓度为0.5mg/mL。生物发光成像显示，在mFluc@RP/P和mFluc@RP/P-KGF处理的小鼠中出现了生物发光信号。值得注意的是，没有明显的信号定位于其他器官（心脏、肝、脾和肾），这表明吸入的纳米制剂生物分布效果很好。通过WB分析一次吸入mMMP13@RP/P-KGF后MMP13在体内的表达情况，作为确定给药间隔时间的参考。此外，通过苏木精和H&E染色评估纳米制剂的潜在毒性，染色切片中未见明显的组织病理学异常。这些结果表明，本研究开发的给药系统具有良好的肺滞留能力和生物相容性。随后，详细研究了博莱霉素诱导的IPF小鼠模型的治疗效果，如图5a所示，给予博莱霉素后10天，小鼠随机分为6组（n=6），给予PBS、mMMP13@RP/P、mEGFP@RP/P-KGF、mMMP13@RP/P-KGF、吡非尼酮和mMMP13@RP/P-KGF、吡非尼酮处理，每3天给药5次，mRNA剂量为750μg/kg，未给予博莱霉素诱导组（n=6）以PBS处理作为对照，灌注博莱霉素25d后处死所有小鼠，收集肺组织进行组织学分析，用具有代表性的H&E染色法显示肺泡结构的完整性，Masson和天狼猩红染色法显示胶原蛋白沉积的程度，平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫组化染色法反映肌成纤维细胞活性（图5b）。与PBS处理组相比，吸入mMMP13@RP/P和mEGFP@RP/P-KGF在治疗期后缓解了IPF，而吸入mMMP13@RP/P-KGF对纤维化消退的影响更显著。吡非尼酮是一种临床批准用于治疗IPF的药物，其可以减少多种促纤维化因子的表达，防止胶原和炎症细胞在肺组织中的积累，与吸入mMMP13@RP/P-KGF在胃内联合给药（图中的G7处理）。在恢复肺泡上皮结构和减少胶原沉积方面，与单独给2种药相比，联合治疗显示出更显著的疗效。通过WB法测定α-SMA的蛋白水平（图5c），分析α-SMA/β-actin比值（图5d），结果表明，在mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮联合给药组中，其蛋白水平显著低于PBS处理组。Ashcroft评分和羟脯氨酸含量的进一步研究证实了这些结果（图5e，f）。为了验证MMP13在体内的表达，让IPF小鼠吸入不同的纳米制剂（图5g），WB检测表明mMMP13@RP/P或mMMP13@RP/P-KGF处理组中MMP13的表达水平高于对照组或mEGFP@RP/P-KGF处理组（图5h，i），说明了mMMP13在体内的高效传递。此外，利用免疫荧光染色法检测MMP13和α-SMA在治疗小鼠肺组织中的共定位，结果显示，与MMP13蛋白对应的红色荧光广泛分布于mMMP13@RP/P处理小鼠的肺组织切片中，相比之下，在mMMP13@RP/P-KGF处理组中，红色荧光主要出现在纤维化灶中（图5g）。另外与PBS处理组相比，mMMP13@RP/P-KGF处理组小鼠的体重显著增加。

图5

图注：G1：生理盐水+PBS；G2：博莱霉素+PBS；G3：博莱霉素+mMMP13@RP/P；G4：博莱霉素+mEGFP@RP/P-KGF；G5：博莱霉素+mMMP13@RP/P-KGF；G6：博莱霉素+吡非尼酮；G7：博莱霉素+mMMP13@RP/P-KGF+吡非尼酮

5.纳米制剂对肺泡修复和肺功能的影响

基于对博莱霉素诱导的小鼠模型的整体纤维化水平的分析，进一步研究了纳米制剂对肺泡修复和肺功能的影响。在IPF中易感的肺泡上皮主要由介导气体交换的AEC1s和分泌表面活性物质的AEC2s和祖细胞组成。作者进一步研究了博莱霉素损伤后不同处理组AEC1和AEC2分布的变化，以评估肺泡损伤和修复。水通道蛋白5（AQP5，AEC1标记物）和表面活性蛋白C（SP-C，AEC2标记物）的免疫染色显示，mMMP13@RP/P-KGF处理组和mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮共同给药组的AQP5和SP-C明显升高，结果表明吸入mMMP13@RP/P-KGF可促进肺泡修复（图6a-c）。这些结果通过WB得到证实（图6d?f）。随后，在治疗期结束时进行多次肺功能测试，以监测随机分组小鼠（n=6）的肺功能变化。结果与肺泡改善效果一致，总肺活量（TLC）、用力肺活量（FVC）、功能残气量（FRC）、最大呼气流量（PEF）、50ms用力呼气容积（FEV50）、肺阻力（RL）、肺动态顺应性（Cdyn） 接近正常水平，mMMP13@RP/P-KGF处理组和mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮共同给药组比PBS处理组更明显（图6g-m）。Kaplan-Meier生存曲线（图6n）显示，与PBS处理组相比，mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮联合处理显著延长了博莱霉素诱导的小鼠模型的生存时间。总的来说，吸入式mMMP13@RP/P-KGF纳米制剂显著加速了博莱霉素诱导小鼠的受损肺泡上皮再生，并改善了肺功能。

图6

研究结论

本研究开发了一种基于核糖体蛋白可吸入的mRNA纳米制剂，该制剂能够降解博莱霉素诱导的IPF小鼠模型中的肺内ECM，使肺泡上皮再生。筛选了最佳的核糖体蛋白来组装蛋白聚合的mRNA核心，以高效传递mMMP13。在该纳米制剂中使用的双功能肽显著提高了靶向性和细胞摄取效率。外层的KGF在纤维化灶中响应性释放，以促进上皮再生，这有助于肺泡重建。体内实验表明，吸入式纳米制剂对缓解IPF有显著的疗效，并表现出  的生物相容性。该工作不仅提供了一种新的mRNA可吸入式递送策略，也为严重IPF的患者提供了一种具有巨大潜力的可替代性疗法。

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