文献背景

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的冠状病毒病 于2019年12月爆发，导致全球健康危机。SARS-CoV-2变异体的快速传播表明，目前批准的抗SARS-CoV-2药物、中和抗体和疫苗的有效性存在局限性。尽管为药物再利用做出了相当大的努力，但治疗和遏制SARS-CoV-2感染仍然需要有效抗病毒活性的新型化合物。SARS-CoV-2的感染需要将SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合域（RBD）与宿主的细胞血管紧张素转化酶2（ACE2）的受体结合。抗SARS-CoV-2中和单克隆抗体（mAbs）被设计用于与S蛋白的RBD或RBD-ACE2结合位点的表位发生靶向相互作用，或被选择具有强大的中和活性，但是其需要对病人每kg体重用量为4-100毫克才能达到有效治疗，储存和运输条件都较为复杂，且抵抗SARS-CoV-2变体几乎无效，特别是针对奥密克戎。因此，需要寻找一种特异性相对较低且具有更广谱治疗能力的替代方法。

纳米材料（NMs）的抗菌和抗病毒能力引起了作者的极大兴趣。金属NMs通过金属原子与病毒组分的相互作用显示出了抗病毒能力，例如金NMs具有可调的表面化学设计，其模拟病毒粘附的硫酸类乙酰肝素已成功应用于抑制各种病毒的感染。由于RBD的β构型和正表面电荷，RBD会优先吸附在带有大量负电荷的二维（2D）NM表面，于是作者筛选了一系列带负电荷的NMs进行抗病毒活性研究。最后确定为超薄二维铜铟磷硫（CuInP₂S₆，CIPS）纳米材料（NSs），其具有强大的抗SARS-CoV-2能力。

基本信息

题目：

A nanomaterial targeting the spike protein captures SARS-CoV-2 variants and promotes viral elimination

期刊：Nature Nanotechnology

影响因子：40.523

PMID：35995853

DOI：10.1038/s41565-022-01177-2

通讯作者：

郑永唐、李红昌、陈春英、王黎明、李洋

作者单位：

中国科学院昆明动物研究所、中国科学院深圳先进技术研究院、国家纳米科学中心、中国科学院高能物理研究所、广东省疾病预防控制中心、广东省公共卫生研究院

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摘要

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行造成全球紧急情况，只有通过有效和广泛的预防和治疗策略以应对，而目前两者仍然存在不足。作者研究了一种超薄二维铜铟磷硫（CuInP₂S₆，CIPS）纳米材料作为抗SARS-CoV-2感染的新药物。针对野生型SARS-CoV-2及其变体（德尔塔和奥密克戎）内部的刺突蛋白受体结合域，CIPS展现出一个高的选择性结合能力（解离常数（KD）< 1 pM），其能抑制病毒进入和感染携带血管紧张素转换酶2（ACE2）的细胞、人呼吸道上皮器官和ACE2转基因小鼠。在与CIPS结合后，SARS-CoV-2病毒被巨噬细胞快速吞噬和清除，这表明CIPS可以成功地用于捕获和促进宿主清除病毒。因此，作者建议CIPS作为一种纳米药物，用于未来安全有效的抗SARS-CoV-2治疗，并作为一种净化剂和表面涂层材料来降低SARS-CoV-2的传染性。

研究内容及结果

1. CIPS在体内外抑制SARS-CoV-2感染

通过扫描电镜和透射电镜测定，片状剥落的CIPS具有多层结构，平均尺寸为～200nm（图1a），通过原子力显微镜测定，平均厚度为～3.1nm图（1b，c）。根据扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）分析，铜原子与硫原子配位（图1d），大部分Cu原子为+1价。硫以硫化物（S^2-）的形式存在。铟原子的化学形式与CIPS的晶体结构相一致，位于两个不同的CIPS表面之间，通过与磷和硫原子配位，稳定地支持CIPS的结构（图1e），铜、硫和磷原子主要定域在其表面，铟原子浸没于其中。

作者评估了CIPS对真实SARS-CoV-2病毒的抗病毒作用。在CIPS存在的情况下，SARS-CoV-2感染Vero-E6细胞48小时后，SARS-CoV-2感染率以CIPS剂量依赖性的方式下降（图1f，g），而细胞活力不受影响，选择性指数（SI，细胞毒性和抗病毒，药物浓度之间的比率）超过17.6（图1g）。相位对比影像（图1h）显示，CIPS抑制了病毒诱导的细胞病变。用CIPS处理被SARS-CoV-2感染的Vero-E6细胞时，CIPS的抗病毒作用也很明显（图1i，j）：病毒感染24小时后加入CIPS仍能有效抑制体外SARS-CoV-2，病毒感染4小时后CIPS抑制作用最大。

图1

CIPS的抗SARS-CoV-2效果采用了气/液界面培养的人呼吸道上皮类器官模型（图1k-n）进行了评估。类器官呈现出多层气道上皮结构，朝向空气的一面是纤毛细胞，模仿人类呼吸道上皮的结构。CIPS处理后，引起SARS-CoV-2复制减少40%（图1k），同时有效保护了被SARS-CoV-2感染后严重破坏的组织完整性（图1l，m）。SARS-CoV-2感染还引起上皮细胞厚度的增加，这是一个持续感染的迹象，而CIPS治疗减少了这种情况（图1n）。

作者评估了CIPS在人ACE2（hACE2）转基因小鼠体内的抗SARS-CoV-2能力。小鼠鼻内感染SARS-CoV-2前后用CIPS（每kg体重4-8mg）进行治疗（图2a，b），并在感染后3天评估肺中SARS-CoV-2的存在情况。2种剂量的CIPS治疗均显著降低了感染率（图2a），CIPS在治疗和预防方面均非常有效（图2b)。组织损伤和白细胞浸润（图2c）、肺部炎症因子的表达降低（图2d），这些均证实了感染率的减少。

相关实验也证明，CIPS对SARS-CoV-2的所有变体均具有很高的结合能力，CIPS可以有效抑制SARS-CoV-2变体的病毒感染。

图2

2. CIPS对SARS-CoV-2的抑制机制

在排除了可能的金属离子影响后（补充图7），作者通过TEM（补充图8a）、CIPS的理化性质的变化（补充图8b,c）和Western blotting（补充图8d）证实了CIPS与SC2-P的相互作用。CIPS能有效地吸附和捕获SARS-CoV-2病毒（图3a、b）以及分离S蛋白。CIPS与S蛋白RBD具有非常高的亲和力（解离常数（KD）<0.001nM，图3c），而对其他血清蛋白和因子的亲和力至少低100倍（图3d）。在复杂的环境中（过量的小鼠肺匀浆或胎牛血清），CIPS对SC2-P的S蛋白保留了很强的结合能力和完整的抗病毒能力（图3e，补充图8h）其他二维纳米材料（MoS₂和氧化石墨烯（GO））显示出明显较低的RBD结合能力（KD=11.7和5.2nM，补充图9）。它们的KD（CIPS?GO＜MoS₂）与它们的抗病毒活性相关。扩展数据图1b）。在RBD与ACE2的结合方面 (KD=11-17.4nM)，与报道的数据一致，如果RBD预先暴露于CIPS，即使在很低的测试浓度（15 fM；图1）下，RBD与ACE2的结合也完全被消除。测试浓度（15 fM；图3f）。与商业化的mAb相比，CIPS的抑制能力显著较高（图3f 和补充图10），通过计算抑制常数(Ki），CIPS为0.053 fM，而mAb为75pM。

通过分子动力学（MD）模拟研究了RBD在CIPS表面的吸附作用，利用ACE2和S蛋白的晶体结构阐明了它们的结合界面，而与ACE2结合的RBD的氨基酸残基被列在扩展数据中。用圆二色技术（CD）对存在或不存在CIPS时RBD的二级结构进行表征，表明大部分RBD结构以β-折叠构象存在（图3g）。由于β-折叠构象促进了非结构蛋白吸附，这可能解释了RBD与CIPS的优先结合。与CIPS结合后，RBD的构象也发生了变化（图3g），α-螺旋和旋转构象数量减少，β折叠构象和随机线圈增加。

图3

3.CIPS促进巨噬细胞清除SARS-CoV-2

作者研究了病毒在与CIPS结合时是否能更好地吞噬和清除病毒。CIPS相关的SC2-P可以在培养24小时后被人巨噬细胞有效吞噬，并且病毒在随后的降解过程中被有效清除（图5a，b）。经巴菲洛霉素（BM）溶酶体抑制后，SC2-P在巨噬细胞中积累（图BM；图5a，b），并与溶酶体共定位（图5c)，这表明大部分SC2-P在吞噬溶酶体中被降解。同样，用真实的SARS-CoV-2病毒进行的实验表明，与CIPS结合的SARS-CoV-2病毒可以被巨噬细胞有效地吸收和清除（图5d，e），而BM抑制溶酶体显著增加了SARS-CoV-2的细胞内水平，说明SARS-CoV-2的清除是溶酶体依赖性的（图5e）。

作者研究了巨噬细胞对病毒的摄取是否只导致病毒的降解，是否也能导致细胞的感染。在使用SC2-P和真实的SARS-CoV-2病毒时，作者观察到CIPS对病毒的摄取是依赖溶酶体的，对CIPS相关病毒的摄取并没有引起巨噬细胞的感染，因为在培养中无法观察到病毒的释放。(图5f,g）。这表明，巨噬细胞可以有效地摄取并清除与CIPS相关的SARS-CoV-2。巨噬细胞在CIPS促进的病毒清除的作用，在hACE2转基因小鼠的体内数据得到进一步证明。CIPS在抑制SARS-CoV-2复制的同时，增强了SARS-CoV-2和巨噬细胞在肺部的共定位（图5h）。

使用透射X射线显微成像结合纳米计算机断层扫描（Nano-CT）观察细胞内CIPS，显示在暴露12小时后，细胞内CIPS大量积累，在无CIPS培养基中48小时后，细胞内CIPS显著下降（图5i）。根据电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析铟含量的结果显示，巨噬细胞对CIPS的吸收是呈时间依赖性的，从培养基中去除CIPS后，铟含量随时间的推移而降低（图5j）。同时成像定量结果表明，CIPS被巨噬细胞降解。用Cu XANES谱分析来定量CIPS在巨噬细胞中积累和降解的化学变化。结果表明，Cu在内化CIPS中的形式为+1价态，Cu以Cu-S的化学形式存在。随着时间的推移，Cu在巨噬细胞中从+1价变为+2价，铜的化学形式从Cu-S到Cu-O/Cu-OOC（图5k，l），这表明在细胞内转运过程中，CIPS从氧化到降解，很可能在酸性吞噬溶酶体中发生。继续监测CIPS的生物分布和降解，显示在肺内6h积累最多，在7天后被完全清除（图5m，n），说明CIPS与巨噬细胞有明确关联（图5o）。

对巨噬细胞中CIPS依赖的病毒清除进行详细的化学分析表明，在溶酶体样酸性环境下铜离子（Cu⁺和Cu²⁺）促进过氧化氢生成羟基自由基。羟基自由基的强氧化能力可能会破坏病毒的结构和蛋白质、脂质、核酸等成分（补充图17a，e）。

为了研究针对SARS-CoV-2的CIPS的吞噬作用是否能促进保护性免疫，作者检测了CIPS上调巨噬细胞活化和抗原呈递相关分子表达的能力。与单独暴露于病毒中的细胞作比较，CIPS上调了SARS-CoV-2处理的巨噬细胞中CD86和HLA-DRA的表达，这是抗原呈递的两个重要分子（图5p）。这些结果表明，CIPS结合的SARS-CoV-2可以促进巨噬细胞中MHC II分子中的抗原呈递，从而可能触发适应性抗病毒免疫应答。

图5

补充图17

结论

2D CIPS NS作为一种有效的纳米胶，通过结合病毒SARS-CoV-2的S蛋白选择性捕获这种病毒，从而抑制宿主细胞的感染。CIPS与SARS-CoV-2的S蛋白RBD的结合亲和力小于1pM，形成了非常稳定的复合物，并且有效结合了SARS-CoV-2 RBD中8个可结合ACE2的氨基酸残基，从而有效地抑制了病毒的感染性。此外，SARS-CoV-2 VOCs所显示的RBD突变并不影响其与CIPS的结合，表明CIPS在抑制病毒变体感染性方面具有广谱性，其在体外和体内的预防和治疗策略中都有明显的效果。综上所述，CIPS是一种安全有效、具有良好生物相容性和生物可降解性的2D 纳米材料，能够抑制SARS-CoV-2的感染并促进清除（图6）。

图6

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