文献背景

细胞免疫疗法已在肿瘤治疗中取得重要的突破性成果，是最有希望消除肿瘤的治疗方法之一。但该方法在实际临床应用中仍存在着困难与挑战。最大的局限性是靶材料胞内递送的有效性，这是很多基因编辑免疫疗法中的关键步骤。因此需要开发高效、低细胞损伤且具有高通量的胞内递送方法，来实现大规模临床应用。脂质体或聚合物诱导的内吞方法对大多数细胞具有价值，但是不适合免疫细胞，因为免疫细胞能够将这类递送载体识别为外来敌对物并将其清除。与由质粒DNA或mRNA间接表达的载体传递系统（即脂质体、聚合物、慢病毒等）相比，更理想的方法是直接递送蛋白质，它可以消除质粒表达的过程，减少培养时间，从而提高转染效率，降低风险。

近年来，基于瞬时膜变形破坏的胞内传递技术备受重视，其几乎可以递送任何亚微米级靶材料，广泛适用于各种细胞。例如电穿孔技术，能够通过在特定电压和频率下一系列的电脉冲来控制细胞膜的瞬时膜变形破坏（即膜的快速打开和关闭）使靶物质能够瞬间递送到细胞内，为免疫细胞转染提供了机会。但这类方法缺乏对膜穿孔变形的精确控制，过度的电场会对细胞行为产生不可预测的影响外，还可能导致细胞成分损伤（如蛋白质变性等）。相比之下，微流控和纳米技术可以精确地控制膜扰动，从而实现瞬时膜穿孔和随后的胞内递送，在解决胞内递送问题中具有潜力。微流控和纳米结构可以适用于多种不同哺乳动物细胞体积和不同尺寸的细胞膜实现膜穿孔。细胞膜的机械扰动可通过微流体剪切、尖锐微纳米结构的挤压和其他手段来实现，纳米技术与激光或电的结合已经证明了膜穿孔的可行性。这种方法可获得很好的胞内递送效果，递送效率约80%。纳米针可在细胞表面相当小的区域内集中作用力，实现精确的膜穿孔和靶物质的胞内递送，在解决细胞内传递效率和细胞活力方面具有巨大潜力。但其应用于悬浮细胞例如NK细胞、T细胞等时仍然存在困难，这类细胞不能自发的接触纳米针，需要在微流控和表面区域共同作用下进行精确捕获和控制，因此阻碍了纳米针在免疫细胞的胞内递送和随后的免疫治疗中的应用。目前的微纳米结构胞内传递技术受到低通量或小剂量的限制，微纳米结构的小组装面积是影响其进一步发展到高通量的关键问题。因此，目前仍需开发针对悬浮免疫细胞的膜穿孔系统，实现高效、低损伤、高通量的胞内递送方法，进而提高其真正的临床应用潜力。

基本信息

题目：

High-Throughput and Efficient Intracellular Delivery Method via a Vibration-Assisted Nanoneedle/Microfluidic Composite System

期刊：

ACS Nano

影响因子：18.027

PMID：

36479877

通讯作者：

汪家道 马原

作者单位：

清华大学

索莱宝合作产品：

摘要

细胞内传递和基因修饰为肿瘤免疫治疗带来了重大变革，但现有方法受限于递送效率低、通量差、细胞损伤过度或不适于悬浮免疫细胞，特别是对难转染的自然杀伤细胞。通过振动辅助纳米针/微流控复合系统利用大面积的纳米针在振动下快速穿刺和分离微通道中快速移动的悬浮细胞，实现连续高通量的细胞内递送。通过大面积自组装技术和微通道所制备的纳米针阵列可以最大限度提高递送效率。Cas9核糖核蛋白复合物（Cas9/RNPs）具有足够的细胞膜纳米穿孔尺寸可直接递送到细胞内，对于难转染的免疫细胞，递送效率高可达98%，细胞活力保持在80%左右。此外其通量显著高于常规递送技术，基因编辑CD96敲除的NK-92细胞通过逆转衰竭具有更高的免疫力，实现高通量、高效率和低损伤性能的胞内递送，该策略提高了胞内免疫疗法的临床应用潜力。

研究内容及结果

1.纳米针/微流控复合胞内递送系统的设计与作用机理

由硅纳米针阵列基底和PDMS微通道组成的细胞内递送芯片的示意图（图1a、1b）。散射区由微米柱阵列组成，可使细胞充分分散防止它们粘成团块（图1c）。平行微通道的高度略高于细胞直径，可使细胞分别穿过穿孔区域，避免细胞堆积和阻塞，提高细胞内递送的阳性率和通量（图1d）。不同流道中的流场条件保持高度一致（图1e）。在穿刺区平行通道的下方覆盖了大面积硅纳米针阵列，通过机械穿刺实现精确的膜穿孔（图1f）。机械振动驱使细胞在微通道中相对运动，使细胞能够快速与纳米针碰撞和脱离，从而实现细胞膜的快速穿孔（图1g）。纳米针的膜穿孔大小可以充分满足要求，可使大分子、蛋白质等物质从周围介质扩散到细胞内基质中（图1g）。典型“站立姿势”细胞被刺穿并连接到纳米针基底上（图1h）。图1i是冻干后纳米针穿刺残留细胞膜的扫描电镜图，可直观地显示膜穿孔。

                                      图1

2.高质量大面积纳米针表面结构的制备

高质量大面积纳米针表面结构的制备策略示意图（图2a）。反应离子刻蚀（RIE）可以调整纳米颗粒的直径，形成非密堆积结构，调整RIE工艺可以精确控制纳米颗粒的直径（图2b）。电子束蒸发沉积和超声波去除纳米颗粒可以获得多孔金膜（图2c）。纳米柱的直径可以通过调整化学蚀刻来精确控制（图2d），通过RIE可以获得大面积纳米针阵列结构（图2e）。

                                          图2

3.振动辅助纳米针/微流控复合胞内递送条件的优化

振动频率从40到70 Hz对细胞形态的影响最小，只有当频率达到70 Hz时，细胞形态才开始轻微变化（图3）。与振动频率相比，加速度对细胞形态的影响更为显著，另外流速对细胞形态的影响很小（图3）。与对照组相比，细胞内递送组具有更高的荧光强度（图1h，i）；细胞内递送组的细胞形态状况良好，无明显变化（图4a）。与对照组相比，在仅振动组或仅纳米针组中没有观察到信号；当振动和纳米结构共存时，细胞内递送性能显著提高，FITC荧光阳性率超过90%；纳米结构的形态影响其胞内递送效率，纳米针组的细胞内递送效率（超过90%）远高于锥形组的纳米ke的细胞内递送效率（约40%）（图4b，c）。在不同流速下，细胞内递送阳性率保持在90%以上；在低流速和过高流速下，细胞活力显著降低；当流速为50 μL/min和400 μL/min时，细胞活力下降；在200 μL/min的优化流速下，细胞活力高达80%，同时保持超过90%的细胞内递送效率（图4d）。使用K562、人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）、原代T细胞和NK-92来评估FITC标记的葡聚糖通过该细胞内递送方法的递送效率，葡聚糖以高于90%的递送效率成功地递送到所有细胞中（图4e）。

                                          图3

                                                图4

4.CRISPR-cas 9的递送和基因编辑NK-92细胞模型的构建

细胞内递送组中可观察到GFP荧光（图5a）。Cas9 + GFP的细胞内递送效率高达约98%，细胞死亡率仅为约20%（图5b，c）。脂质体胞内传递的递送阳性率仅为5%左右（图5d）。电穿孔的递送效率和细胞存活率分别约为40%和50%（图5e，f）。与NK-92细胞相比，敲除效率约为46%（图5h）。CD96位点存在明显的基因切割（图5i）；基因敲除后CD96蛋白的表达明显减弱（图5j）；敲除CD96后NK-92细胞的IFN-γ水平明显升高（图5k）。细胞内递送量超过50 mL，递送效率可保持在90%以上（图5l）。与对照组相比，CD96^?NK-92细胞通过逆转衰竭具有更高的免疫力（K562死亡率在0至12小时期间较高）（图6a）。CD96^?NK-92组K562细胞12 h后死亡率比对照组高10%以上（图6b）。未来将构建一个原型来实现真正临床应用的目的（图6c）。

                                          图5

                                                   图6

结论

近年来细胞免疫不断发展，基因修饰NK细胞的免疫治疗机制日益明确，瓶颈问题是如何有效实现靶材料的胞内递送和基因编辑。高效、标准的细胞内传递技术是其进一步发展的关键。基于微纳米粒子自组装模板的制备技术是形成大面积微纳米阵列结构的重要手段之一。作者将大面积纳米针与微流控技术相结合形成振动辅助纳米针/微流控复合系统，纳米针的尺寸与靶Cas9蛋白相匹配且通过机械膜穿孔成功实现了高通量、高效和低损伤的NK-92胞内递送和遗传修饰。CD96敲除NK-92细胞中发现，抑制CD96可显著提高NK-92细胞的免疫功能，表明该系统进一步在免疫治疗临床应用中的巨大潜力。

与目前的CAR-T免疫治疗方法相比，NK细胞相关的免疫治疗具有更好的安全性、多种激活细胞毒活性的机制等优点。一旦安全性和制备方面的问题得到解决，其有望在癌症治疗中带来更好的效果，NK-92细胞基因编辑结果表明该系统能实现这一功能。未来工作中将构建原型，以达到真正临床应用的目的。

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