文献背景

冠状动脉闭塞引起的心肌梗死（MI）是心血管疾病致残和死亡的主要原因。炎症和炎性细胞浸润是心肌损伤的重要指标。在心肌梗死早期，大量的炎性细胞被招募并分泌多种炎症介质，加剧了心肌损伤。心肌梗死后适当应用抗炎治疗可能是其治疗的关键步骤。

雷公藤甲素（TPL）是从中药雷公藤中分离得到的具有药理活性的化合物，具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等生物学功能。基于TPL在心血管疾病中的治疗应用，TPL可能对MI有良好的治疗效果。然而，TPL全身给药可能会引起肝肾毒性，可通过原位注射在心脏内局部缓释来解决TPL肝肾毒性问题。聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）是一种可生物降解的共聚物。PLGA纳米颗粒可以包裹各种药物，提高生物利用度并提供持续的药物释放，但PLGA纳米颗粒的缺点之一是会发生药物突释，并且在突释阶段过度释放药物可能是有毒的。水凝胶是心脏组织工程中常用的材料，也是心肌组织修复药物缓释的良好平台，因此可以考虑构建水凝胶和PLGA纳米颗粒双重缓释平台。Pluronic F127是一种由聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（PEO-PPO-PEO）组成的共聚物，可在体温下转变为凝胶状态，在较低温度下保持液态。F127水凝胶中的药物通常会在4天内释放，可以防止PLGA纳米颗粒在药物释放初期的药物突释。

该研究通过网络药理学评估了TPL抗心肌梗死的可能性和机制，作者设计了由TPL@PLGA和Pluronic F127组成的双重缓释系统（TPL@PLGA@F127）。TPL@PLGA纳米颗粒可在水凝胶中充分分散，实现TPL的长期释放。TPL@PLGA@F127可避免PLGA引起的药物突然释放，为TPL治疗提供可持续的支持。最后通过体内和体外实验评估了早期（MI术后3天）和后期（MI术后28天）对MI的影响以及早期对正常器官的毒性（流程图如下）。

流程图

基本信息

题目：

Triptolide with hepatotoxicity and nephrotoxicity used in local delivery treatment of myocardial infarction by thermosensitive hydrogel

期刊：

Journal of Nanobiotechnology

影响因子：10.2

PMID: 37461079 

通讯作者：

赵军 高再荣

作者单位：

同济大学医学院、上海东方医院等

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摘要

冠状动脉闭塞导致的心肌梗死（MI）是全球心血管致残和致死的主要原因。抗炎治疗在MI治疗中发挥着重要作用。雷公藤甲素（TPL）作为一种中药单体，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。但研究证明TPL水溶性差，具有明显的肝肾毒性，因此制备水凝胶平台（TPL@PLGA@F127），通过心肌内注射测试了其在MI早期（MI术后3天）对正常器官的作用和毒性。结果表明TPL@PLGA@F127不仅能在心肌梗死术后第3天促进巨噬细胞的"修复"极化（向M2巨噬细胞极化），而且在MI后期（MI术后28天）具有持久的抗炎作用。TPL@PLGA@F127可以更缓慢、更稳定地释放TPL减轻其毒性。通过观察TPL@PLGA@F127对MI的长期影响，发现其具有改善心功能、抑制心肌纤维化、保护心肌细胞的作用。综上所述，TPL@PLGA@F127不仅能增强TPL对MI的治疗效果，还能减轻肝毒性和肾毒性，为TPL治疗MI的临床应用奠定了坚实的理论基础。

研究内容及结果

1.TPL抗心肌梗死的网络药理分析

从数据库（GeneCards、DrugBank、OMIM、CTD）和药物数据库（TCMSP、GeneCards）中分别获得2005个与MI相关的基因和227个与TPL相关的基因，通过基因之间的相互作用获得了126个与MI治疗相关的核心基因（图1A）并生成PPI网络（图1B），发现肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）位于网络的核心。为确定TPL对MI作用的详细机制，基于126个核心靶点进行了GO富集，主要集中在生物过程（BP）（图1C）的分析，基于PPI网络和GO富集的生物信息，使用Cytoscape软件形成了化合物-靶点-生物过程（C-TB）网络（图1D）。

图1

2.TPL@PLGA@F127的表征

采用双乳化-溶剂蒸发法合成具有球形结构的TPL@PLGA（图2A），PLGA和TPL@PLGA的平均水动力直径、多分散指数（PDI）和Zeta电位分别为157.67±1.06 vs.163.63±3.72nm、0.24±0.02 vs. 0.24±0.02和-13.93±1.02 vs.-11.97±0.7mV，TPL@PLGA包封率为9.04%（图2B）。在F127中加入PLGA纳米颗粒并没有显著改变F127水凝胶的系数，F127和TPL@PLGA@F127的相变临界温度均为23℃（图2C）。

图2

3.TPL在TPL@PLGA@F127平台中的体外释放和体内滞留

TPL@F127在第4天体外释放率接近100%，而TPL@PLGA和TPL@PLGA@F127的释放率分别为56.21±3.53%和23.81±3.30%（图2D）。将DIR标记的DIR@PLGA和DIR@PLGA@F127注射到MI后1小时和24小时的大鼠心肌内。注射后1h，部分DIR@PLGA已从心肌中脱落，而DIR@PLGA@F127则全部集中在注射部位。在24 h时，DIR@PLGA的荧光强度与背景荧光强度相同，而DIR@PLGA@F127仍然可以观察到荧光（图2E和F）。

4.TPL@PLGA@F127在体外和体内实验中调节免疫过程

TPL浓度超过20nM时可显著抑制巨噬细胞的活力，而TPL@PLGA或TPL@PLGA@F127处理的细胞，即使在较高的TPL浓度下也没有明显的抑制作用（图3A）。20nM的TPL浓度下调了巨噬细胞表面CD86（M1巨噬细胞亚型标记）的表达，上调了CD206（M2巨噬细胞亚型标记）的表达（图3B）。TPL@PLGA@F127组和TPL@F127组在增加CD206阳性细胞和减少CD86阳性细胞方面效果更好（图3C-E）。

图3

5.TPL@PLGA@F127早期生物安全性评价

对各组大鼠主要脏器的结构进行评估，TPL（i.p.）组肝组织炎性细胞浸润、坏死、细胞结构受损（箭头所示），TPL（i.p.）组肾组织有严重的细胞水肿和空泡变性，而TPL@PLGA@F127组未观察到这些异常（图4）。

图4

6.TPL@PLGA@F127具有优异的长期抗炎效果

巨噬细胞是参与慢性炎症过程的主要炎症细胞，CD68是巨噬细胞的关键生物标志物。TPL@PLGA+F127组巨噬细胞浸润明显少于TPL@F127组（图5A,5B）。TPL@PLGA@F127在梗塞心肌中表达TNF-α较少，IL-10较多（图5C-F）。

图5

7.TPL@PLGA@F127抑制心肌细胞凋亡保护心肌微结构

TPL@PLGA@F127组的TUNEL阳性细胞率低（图6A-C）。TPL@PLGA@F127、TPL@PLGA和TPL@F127均能降低Caspase 3剪切体的表达（图6D和E）。TPL@PLGA@F127组、TPL@PLGA组和TPL@F127组与生理盐水组相比在梗死心肌中有更高的连接蛋白43（CX43）和α-肌动蛋白表达（图6B）。TPL@PLGA@F127组与TPL@PLGA组和TPL@F127组相比，CX43和α-肌动蛋白的表达量最高（图6F）。

图6

8.TPL@PLGA@F127增强心肌梗死后的心功能

在治疗后第28天通过超声心动图测定心脏功能（图7）。与生理盐水组相比，TPL@PLGA组、TPL@F127组和TPL@PLGA@F127组的左心室射血分数（EF，图7G）和缩短分数（FS，图7D）升高，舒张末期左心室内径（LVIDd，图7C）、收缩末期左心室内径（LVIDs，图7B）、舒张末期容积（EDV，图7F）和收缩末期容积（ESV，图7E）均有不同程度的下降（图7A-G）。

图7

9.TPL@PLGA@F127抑制心肌纤维化

生理盐水组胶原体积最大，心室厚度最薄。与生理盐水组相比，TPL@PLGA@F127组的心室厚度正常，胶原沉积更少（图8A和8C-D）。TPL@PLGA@F127组的胶原I/III比值明显低于其他组（图8B，E）。TPL@PLGA@F127能显著降低胶原I的表达和胶原I/III的比例（图8F-H）。

图8

结论

这项研究基于PLGA的缓慢降解、F127的心内滞留以及二者之间的协同作用开发了一种长效水凝胶平台（TPL@PLGA@F127）。研究结果表明TPL@PLGA@F127不仅对心肌梗死有良好的治疗效果，还能减轻TPL对正常器官的毒性。TPL@PLGA@F127能在3天内使巨噬细胞向抗炎表型（M2巨噬细胞）极化，从而更有效地减轻心肌梗死的炎症过程，在早期阶段保护心肌细胞，并长期改善心脏功能。

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