免疫组织化学或者免疫细胞化学，是基于抗原-抗体相互识别作用，在光学显微镜的水平上利用抗体特异性结合，对组织或细胞内的特异性抗原进行定位的一种方法。目前该方法被广泛地应用于病理诊断及科研实验当中。小编这次和大家聊一聊当年自己在科研生涯中踩过哪些免疫组化的坑？

一般来说，组织需经过固定、脱水、包埋之后再进行免疫组化染色，其中固定是踩坑的第一步，目前常用的交联固定剂一般为甲醛类，但是不排除某些特定组织有特殊固定液（如昆虫等）。如果组织固定不充分，极易造成抗原的聚集、弥散或者异位。小编就遇到过一次抗原异位，整张片子上分不出来哪里是阳性，像这样。

迈过第一个，紧接着我们来聊聊第二个坑，抗原修复。目前广泛应用的是热修复和蛋白酶K修复，前者是利用加热将醛基交联的蛋白质共价键打开，使得抗原表位暴露出来，后者是利用蛋白消化方法打开的交联键，常用于容易脱片的组织。热修复常用的两种不同的抗原修复液：柠檬酸钠pH 6.0和EDTA pH 8.0，两种修复液的pH不同，导致最后抗原暴露后恢复的构象可能会有所差异。说到这里，大家可能很困惑，究竟要怎样选择抗原修复液呢？小编推荐给大家一条捷径立即联系购买抗体的制造商，如果实在无法获得相关信息建议从用柠檬酸钠pH6.0开始尝试。

如果说运气足够好，能够成功跳过前两个坑，第三个坑是一个隐藏的难点：一抗的孵育方式。大部分情况下，小编都会使用4度过夜的方式进行孵育，但是偶尔闹点小情绪，想要尽快的结束实验，也尝试过37度孵育一小时，不得不说，这种方法不仅时间短，背景色还很高呢。最关键的是，不是所有抗体都适用于37度孵育一小时，小编的实验生涯滑铁卢之一就是预实验的时候进行4度过夜的方式进行孵育，效果很好，正式实验使用37度孵育一小时之后发现，没有染色，结果不仅是重做还要被师姐熊。

说了这么多，其实只是冰山一角，前期封闭内源性HRP，中间的血清封闭非特异性位点，最后的DAB显色镜检、苏木素返蓝都是事故多发地区。对于鲜少进行免疫组化实验室来说，更是难上加难。

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