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教你成为平淡无奇的WB实验小能手—常见问题篇

2021-02-05

 


Weatern blot原理



蛋白质印迹(Western Blot,WB)又称为免疫印迹(Immunoblot),其是利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将样品中分子量大小不同的蛋白分开,然后通过电转移的方法将凝胶中的蛋白几乎原位、定量地迁移、固定到固相膜上,再利用抗原、抗体的特异性结合反应以及特殊的抗体标记技术,进而对目的蛋白进行定性、相对定量检测的技术。




常见问题

Q

蛋白提取后可以存放多久?


A:

蛋白提取后-80℃可保存一年。建议分装保存,避免反复冻融。

Q

蛋白提取时用进行超声破碎吗?



A:

一般建议进行超声处理,这样可使样本裂解更充分,对于核蛋白、核染色质相关蛋白等难提取、复杂的蛋白,超声处理是关键因素。

Q

做组织样品蛋白的WB的时候,提取蛋白

有什么特别注意的吗?



A:

必须进行研磨、匀浆处理,最好做超声处理,使蛋白质溶解度会更好,离心要充分。组织中的蛋白酶活性更强,需要加入抑制蛋白酶活性的抑制剂,防止蛋白降解。

Q

蛋白含量测定方法的选择?



A:

提取的样品中若含有去垢剂则需要选用BCA法进行蛋白浓度测定,若样品中含有螯合剂(EDTA,EGTA)、还原剂(DTT,巯基乙醇)和脂类等,则需要选用Bradford法进行蛋白浓度测定。

Q

WB实验中样品上样量是多少?



A:

细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量一般为20-40μg,纯化蛋白的上样量一般为10-100ng。

Q

WB实验中一般需要多少个细胞?



A:

一般5×106足够。但要看是哪种细胞,有的细胞的体积就很小,而有的细胞则铺得很开。常规做WB一个孔道上样要105个细胞。但也和目的蛋白及提取的方式有关。如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。

Q

电泳后为什么会出现“微笑”或

“倒微笑”条带?



A:

a)“微笑”是因为灌胶的时候冷却不均匀,中间部分冷却不好,导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。

b)“倒微笑”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的,特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全,加APS和TEMED后应该混合均匀。

c)电泳和转膜温度过高,点样量太多或每孔点样量不均匀,电泳电压不稳定或过高都可能引起条带不整齐的现象。

Q

转膜注意事项?



A:

a)滤纸、胶、膜之间的大小,一般是滤纸≥膜≥胶。

b)滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡,气泡会造成短路。

c)保持膜的湿润,若FVDF膜干燥,需要重新用甲醇活化。

Q

脱脂奶粉和 BSA 封闭有区别吗?



A:

一般来讲,BSA 会产生更清晰的结果,因为 BSA 含有较少的蛋白,抗体与之发生交叉反应的概率较低。但并非总是如此,有些抗体在脱脂奶粉中的封闭效果更好,因为脱脂奶粉中含有更多种类的封闭蛋白,能封闭更多不同类型的蛋白质。

Q

一抗二抗用什么稀释?



A:

一抗可用封闭液稀释。二抗可用TBST稀释,若感觉背景高也可以用封闭液进行稀释。若使用商品化的WB抗体稀释液,则需要注意稀释液中是否还有防腐剂(NaN3),若含有则不能稀释HRP标记二抗。

Q

目的蛋白分子量为何与实际不符?



A:

a)翻译后修饰:蛋白发生如磷酸化、糖基化等翻译后修饰时分子量会增加;

b)翻译后剪切:蛋白发生剪切时分子量会降低,某些蛋白在合成时是作为前提蛋白合成的,然后剪切形成活性形式;

c)剪切异构体:同一基因经不同剪切方式可能产生不同大小的蛋白;

d)多聚体:比如蛋白二聚化;

e)电泳,胶浓度,蛋白Marker等因素也会影响实际蛋白分子量的判断。

Q

内参抗体的选择?



A:

a)内参与目的蛋白分子量最好相差5KD以上

b)不同组织样本在选择内参时存在一定差别


Q

WB实验结果条带很弱或者无目的条带



A:


Q

WB实验结果非特异性条带多



A:


Q

WB实验结果背景偏高



A:


Q

WB实验中其他常见的问题



A:


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