常规的抗生素是治疗细菌感染最广泛的手段，然而多重耐药性（MDR）正成为细菌感染临床治疗中的巨大挑战，特别是对于慢性不愈合伤口感染而言，这增加了患者的发病率和死亡率。近年来，具有小尺寸和高比表面积的纳米材料被广泛用于抗细菌感染方面。由于纳米材料的抗菌机制与传统抗生素不同，导致细菌耐药的可能性较小，可作为抗生素的替代品。银纳米颗粒（AgNPs）具有突出的广谱抗菌性能和显著的抑菌效果，但AgNPs和释放的Ag⁺在高浓度下均表现出严重的细胞毒性；同时，AgNPs极易团聚会显著降低其抗菌效率，从而阻碍其实际应用。为了解决这些问题，构建具有良好分散能力的抗菌杂化材料成为一种新的发展趋势。

光热治疗（PTT）具有空间分辨率高、微创、组织穿透力强等优势，由于其独特的抗菌机制，产生耐药性的可能性较小。因此，抗菌剂与近红外激光（NIR）联合使用可能是一种更有前途的策略，可以弥补PTT的局限性，提高杀菌性能。到目前为止，已有多种具有光热效应的金属材料用于细菌杀灭和伤口愈合研究，其中，普鲁士蓝（PBNPs）具有在NIR吸收能力强、光热转换性能高、稳定性好、生物相容性好、生物安全性高、成本低等突出优势。此外PBNPs也可直接锚定AgNPs，从而有效避免AgNPs的聚集并控制Ag⁺的释放。

湖南大学生物学院刘斌副教授课题组构建了一种多功能的纳米抗菌复合物PB@PDA@Ag用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染。聚多巴胺（PDA）被涂覆在PBNPs表面，通过化学反应形成PB@PDA NPs；然后通过原位还原在PDA表面直接合成AgNPs，形成PB@PDA@Ag。在此过程中，PDA作为还原剂和稳定剂。此外，PDA具有良好的光热效应，可提高其抗菌活性和生物相容性。在这项研究中，作者通过PB@PDA@Ag的抗菌特性和NIR照射下的光热效应，证明了这种纳米平台在体外根除多药耐药细菌的能力。更重要的是，该联合策略对MRSA感染的糖尿病创面具有显著的治疗效果。

基本信息

题目：

PB@PDA@Ag nanosystem for synergistically eradicating MRSA and accelerating diabetic wound healing assisted with laser irradiation

期刊：Biomaterials

影响因子：10.317

PMID：32171103

通讯作者：王炜教授和刘斌副教授为并列通讯作者

作者单位：湖南大学；湖南中医药大学；湖南师范大学

索莱宝合作产品：

产品名称	产品货号
Dopamine Hydrochloride 盐酸多巴胺	ID0370

摘 要

多重耐药性细菌感染和慢性创面愈合正成为临床治疗中的巨大挑战，迫切需要开发新型抗菌材料和治疗策略，尤其对于患有MDR感染的糖尿病患者。在这项工作中，命名为PB@PDA@Ag的纳米复合物被用于在NIR照射下协同根除多药耐药细菌和加速耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的糖尿病创伤模型的伤口愈合。体外研究显示：与单独的PB@PDA@Ag或NIR激光照射相比，这种联合抗菌策略通过破坏细胞完整性、产生ROS、降低ATP、氧化GSH等途径发挥协同抗多药耐药菌MRSA作用；体内实验表明：该策略通过减轻局部炎症反应和诱导创面血管内皮生长因子（VEGF）表达来促进MRSA感染的糖尿病创面愈合。同时，该PB@PDA@Ag具有良好的生物相容性，基本不会对重要器官造成额外的损害。综上所述，PB@PDA@Ag和NIR联合抗菌策略在临床感染领域具有巨大的应用前景。

研究内容及结果

1、PB@PDA@Ag的构建与表征

按照方案一将PB置于最里层，PDA包裹PB后充当纳米Ag的载体构建PB@PDA@Ag。TEM结果表明：PB NP平均尺寸约为88 nm，PB@PDA的平均尺寸约为104 nm，表明PDA涂层的平均厚度约为8 nm（图1A-B）；AgNPs在PB@PDA表面上呈均匀分布（图1C）。PB NPs的zeta电位随着PDA的包裹而降低，AgNPs（Ag⁺）的加入导致PB@PDA的zeta电位从-17mV增加到-12mV（图1D）。XRD表明：与PB@PDA相比，特征衍射峰存在于38.3°，对应于金属Ag的（111）面（图1E）。拉曼光谱检测显示（图1F）：PB NP的拉曼峰位于2154 cm^-1；PB@PDA和PB@PDA@Ag的拉曼峰在1402 cm^-1和1578 cm^-1处。XPS表明：由于PDA层的存在，PB@PDA和PB@PDA@Ag未观察到明显的Fe 2p峰（图1G）。紫外可见吸收光谱检测显示（图1H）：PB NPs在720 nm附近有强吸收峰；PB@PDA的吸光度峰移至710 nm；PB@PDA@Ag在440 nm附近有明显吸收峰。FT-IR检测显示（图1I）：PB NPs在2080 cm^?1有特征峰；加入PDA后，在约3420 cm^?1处出现了一个较宽较强的谱带。以上结果表明PB@PDA@Ag的构建成功。

图1

2、PB@PDA@Ag具有较高的光热转换效率和优异的光稳定性

为了证明PB@PDA@Ag NPs作为PTT的光热剂的能力，系统地比较了不同纳米材料在NIR下的光热效应。结果表明：在808 nm NIR照射8 min后，PB、PB@PDA及PB@PDA@Ag的温度升高分别为31.9℃、33.2℃和30.9℃，而纯水的温度仅升高1.7℃（图2A）；实时光热图像直接显示了它们的光热效应（图2B）。PB@PDA@Ag具有激光密度依赖性和浓度依赖性的光热转换（图2C-D）。PB@PDA@Ag的光热转换效率为30.35%（图2E）。在1 W/cm²的激光照射5个循环后，PB@PDA@Ag吸收没有降低，并维持恒定的光热转换效率，表现出较高的光稳定性（图2F）。因此，PB@PDA@Ag是一种很有前途的PTT试剂。

图2

3、PB@PDA@Ag+NIR具有更强的体外抗菌活性

采用琼脂扩散法和NIR评价不同纳米材料的抗菌能力。相对于其他实验组，PB@PDA@Ag处理组所有受试菌的抑菌圈都清晰可见（图3A）；金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠杆菌和AmprE的抑菌圈直径分别约为14毫米、14毫米、16毫米和21毫米（图3B）；表明PB@PDA@Ag对革兰氏阴性菌E.coli和AmprE.coli的抑制作用更强（图3C）。PB+NIR处理组MRSA和AmprE.coli存活率分别为33.0%和25.8%；PB@PDA@Ag处理组的存活率分别为33.3%和25.4%（图3D-E）；PB@PDA@Ag+NIR处理组中，分别约99.77% MRSA和99.99% AmprE被杀死（图3F-I）。

图3

通过Calcein-AM/PI实验分析不同处理组细菌的膜完整性。生理盐水、NIR、PB和PB@PDA处理组中仅观察到强烈的绿色荧光；PB+NIR、PB@PDA+NIR和PB@PDA@Ag处理组同时观察到绿色和红色荧光；PB@PDA@Ag+NIR处理组观察到强烈的红色荧光和极弱的绿色荧光（图4A）。使用ImageJ软件定量分析表明：与其他组相比，PB@PDA@Ag+NIR的抗菌功效最高（图4B）。SEM图像表明在用生理盐水、NIR、PB或PB@PDA处理后，MRSA具有完整且光滑的表面；PB+NIR、PB@PDA+NIR或PB@PDA@Ag处理后，细胞表面出现明显的下垂和收缩（红色箭头所示）等破坏；而用PB@PDA@Ag+NIR处理后，细菌的结构完全被破坏（图4C）。

图4

4、PB@PDA@Ag的抗菌机理

监测ROS水平，发现相较于其他处理组，PB@PDA@Ag+NIR处理组的ROS水平显著上调（图5A-B）。Ellman测定表明，PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR的GSH氧化水平分别高达45.8%和58.7%（图5C）。检测细菌内ATP水平的变化发现：PB+NIR、PB@PDA+NIR、PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR处理组分别导致细菌ATP水平下降约47.8%、53.1%、77.8%和96.7%（图5D）。这些结果表明：PB@PDA@Ag+NIR的抗菌作用是通过诱导ROS产生、氧化GSH和降低ATP等途径进行的。同时，与对照组相比，PB@PDA@Ag+NIR处理的细菌蛋白质渗漏增加了1.9倍（图5E），表明PB@PDA@Ag+NIR对细菌细胞膜造成了严重破坏。

图5

5、PB@PDA@Ag+NIR对MRSA生物膜损伤最大

持续性细菌感染与生物膜的形成密切相关，生物膜可以抑制抗生素的渗透，逃避宿主吞噬细胞的先天免疫攻击。作者检测了不同处理对MRSA形成的生物膜的影响（图6A-C）：与对照组相比，单独的NIR、PB和PB@PDA处理对MRSA生物膜的影响可以忽略不计；PB@PDA@Ag、PB+NIR和PB@PDA+NIR处理后，可以去除约51%~52%生物膜；PB@PDA@Ag+NIR处理后，可去除约76%生物膜。

图6

6、PB@PDA@Ag+NIR对体内伤口的愈合效果最好

将MRSA感染伤口的雌性Balb/c小鼠随机分为八组（图7A），NIR照射5分钟后，用PB、PB@PDA或PB@PDA@Ag处理的伤口区域的温度增加到约53°C；PBS+NIR处理的伤口区域仅升高1.2°C（图7B）。图7C为在不同时间点进行各种处理的伤口闭合的代表性照片。治疗8天后，PBS、NIR、PB、PB+NIR、PB@PDA、PB@PDA+NIR、PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR组感染创面面积分别减少至58.79%、59.24%、56.81%、47.90%、51.46%、41.77%、41.88%和22.79%（图7D）。此外，在所有组中均未观察到体重的显著波动（图7E），表明这些测试的纳米材料对小鼠具有良好的生物安全性。

通过H&E染色进行炎症分析，相较于其他实验组，PB@PDA@Ag+NIR处理后，伤口上的炎症细胞数量显著减少。此外，在PB@PDA@Ag+NIR组中可以清楚地观察到完整的表皮层（由红色箭头表示）；对于其他组，不完整的表皮层伴有明显的组织损伤（图7F）。

图7

7、PB@PDA@Ag+NIR有效促进体内MRSA感染的糖尿病伤口愈合

通过MKR转基因糖尿病小鼠模拟临床伤口模型，对MRSA感染的糖尿病伤口模型的体内抗感染功效进行评估（图8A）。不同给药方式处理后，在第12天，PB@PDA@Ag+NIR处理组的创面几乎完全愈合（图8B-C）。与空白对照组相比，PB@PDA@Ag+NIR给药组小鼠的体重变化可以忽略不计（图8D），这证实了PB@PDA@Ag+NIR对小鼠的低毒性。通过比较感染区域的细菌CFU显示，PB@PDA@Ag+NIR的杀菌效果最高（图8E-F）。免疫荧光染色显示，与其他组相比，PB@PDA@Ag+NIR处理组的感染创面VEGF表达水平最高（图8G-H）。

综上所述，我们推测PB@PDA@Ag+NIR促进伤口慢性愈合的机制可能与以下原因有关：（1）PB@PDA@Ag光热效应产生局部热疗，释放Ag⁺，消除感染创面大部分细菌；（2）PB@PDA@Ag+NIR给药后可显著降低创面的炎症反应；（3）VEGF显著上调可增加创面组织中新生血管的形成。在新生血管的帮助下，促进参与创面愈合的细胞代谢和增殖，促进再上皮化，实现创面高效愈合。

图8

8、生物安全性评估

对血清进行肾功能和肝功能分析，未发现PB@PDA@Ag对机体有任何毒性（图9A-B）。H&E染色显示：PB@PDA@Ag+NIR治疗期间未对各器官的正常解剖结构造成损伤或毒性（图9C）。这些结果证明了PB@PDA@Ag可以有效、安全的根除MDR细菌引起的慢性伤口感染。

图9

结 论

本研究中，作者创造性的将AgNPs加载到PAD修饰的PB NPs复合物表面，成功构建了一种组合抗菌系统PB@PDA@Ag。体外实验表明，PB@PDA@Ag联合NIR通过破坏细胞完整性、产生ROS、降低ATP和破坏细菌代谢，可以有效治疗多药耐药病原体。MKR小鼠模型体内研究表明：PB@PDA@Ag与NIR激光照射联合治疗后，通过减轻创面炎症反应和诱导VEGF表达来促进MRSA感染的糖尿病创面愈合，对体内无明显毒性。综上所述，本研究提供了一种有效的抗菌治疗策略，在治疗慢性感染性伤口方面显示了巨大的潜力。

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