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AnnexinV Alexa Fluor488/PI 凋亡检测试剂盒 CA1040
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  • 建议零销价:680元/盒
  • 发布日期: 2019-12-18
  • 更新日期: 2019-12-18
产品详细说明
品牌: solarbio CAS编号:
产地: 北京 货号: CA1040
纯度: % 用途范围:
规格: 20T/50T/100T 是否进口:

产品简介:
 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性,对 PS 有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是 完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以采用Annexin V与PI 双染的方法,通过流式检测细胞早期凋亡。

操作步骤:
1、细胞样品的准备:
a)对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含 EDTA 的胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm 左右离心 5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约 50μl 左右的培养液,以避免吸走细胞。
加入约 1ml 4℃预冷的 PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清;
b)对于悬浮细胞:1000rpm 左右离心 5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约 50μl 左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约 1ml 4℃ 预冷的 PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清;
2、用去离子水按 1:3 稀释结合缓冲液(4ml 4x 结合缓冲液+12ml 去离子水);
3、用 1x 结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为 1-5×106/ml;
4、取 100μl 的细胞悬液于 5ml 流式管中,加入 5μl Annexin V/Alexa Fluor 488 混匀后于室温避光孵育 5 分钟;
5、加入 10μl 20ug/ml 的碘化丙锭溶液(PI),并加 400μl PBS,立刻进行流式检测。

实验设计:

1、空白管:阴性对照组细胞,不加 Annexin V/Alexa Fluor 488,碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压;
2、单染管:阳性对照组细胞,只加 Annexin V/Alexa Fluor 488。用于调节补偿;
3、检测管:处理的细胞,加 Annexin V/Alexa Fluor 488,碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。

注意事项:

1、Annexin V 是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和,而 PS 在不同种属间没差异。在正常细胞中,PS 只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,PS 由脂膜内侧翻向外侧;
2、低浓度胰酶消化,轻柔吹打贴壁细胞 2~3 次,离心机 4℃1000rpm 5min 离心,处理得当的话,胰酶造成损伤可以控制在 5%以内,有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3、先加PI 不仅染色是否每组都均匀充分很难判断,而且 PI 本身对细胞也是有毒性的,对实验结果影响会比胰酶大,不建议这样做;
4、Annexin V 是Ca 依赖的蛋白,所以不能加入 EDTA,防止 EDTA 螯合了 Ca 离子从而影响 Annexin V,进而影响结果。
5、用流式检测凋亡时,PI 受时间的影响很大,因标记了 PI 后会加大细胞毒性,随着时间延长会导致 PI 的染色增加,特别是检测早期凋亡时,如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外,误差会明显加大。一般 PI 加上后立刻上机,然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以,但是按照我们操作步骤造成的误差会更小。


相关文献:

《The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell》 作者:Ruifeng Zhao , Jing Jin , Xinyu Sun , Kai Jin , Man Wang , Mahmoud F. Ahmed , Qisheng Zuo , Yani Zhang ,Zhenhua Zhao , Guohong Chen , Bichun Li 期刊:Journal of cellular Biochemistry 影响因子:3.062 PMID:30076744
《Leukemia inhibitory factor promotes extracellular matrix synthesis in degenerative nucleus pulposus cells via MAPK-ERK1/2 signaling pathway》 作者:Hao Zhou,Jieliang Shen,Zhenming Hua,Xiaoming Zhong 期刊:Biochemical and Biophysical Research Communications 影响因子:2.705 PMID:30446227



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