产地 | 中国 |
品牌 | solarbio |
货号 | P2250 |
用途范围 | 细胞分离 |
纯度 | % |
规格 | 200ml/kit |
保质期 | 1年 |
是否进口 | 否 |
商品货号: | 商品品牌: | 规格 | 基本售价: | 选择规格 |
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P2250-200ml/KIT | Solarbio | 200ml/KIT | 800.00元 |
保存:本产品对光敏感,应该室温避光储存,保质期2年。无菌开封后,保存于室温。
试剂盒组成:
试剂A 200mL
试剂C 100mL
细胞洗涤液 200mL
全血及组织稀释液 200mL
红细胞裂解液 100mL
操作步骤:
1. 制备脏器组织的单细胞悬液。
2. 细胞悬液体积小于5mL时,在离心管中先加入4mL试剂A,后将2mL试剂C小心叠加于试剂A之上,形成梯度界面(细胞悬液体积大于等于5mL,试剂A与试剂C比例2:1,试剂总量与稀释后的样本量相等。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二,否则会影响分离效果),将细胞悬液平铺到分离液液面上方,注意保持两液面界面清晰。(可以使用巴氏德吸管吸取细胞悬液,然后将细胞悬液小心的平铺于分离液上,因为两者的密度差异,将形成明显的分层界面。如果样品较多,加样的时间较长,在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。)
3. 室温,水平转子500~1000g,离心20~30min(细胞悬液的体积越大所需的离心力越大,离心时间越长,*的分离条件需摸索,离心转速*不超过1200g)。
4. 离心后,离心管中将出现两层环状乳白色细胞层,上层细胞为单个核细胞层,下层细胞为中性粒细胞层,如图所示(个体差异或者是分离条件不同,粒细胞层可分离不明显)。
5. 用吸管小心吸取试剂C与试剂A之间以及试剂A中的中性粒细胞到15mL洁净的离心管中,10mL PBS或细胞洗涤液洗涤细胞。250g,离心10min(如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液)。
6. 弃上清,5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞,250g,离心10min。
7. 重复步骤6
8. 弃上清,细胞重悬备用。
脏器组织单细胞悬液的制备方法
脏器组织研磨的方法:
1. 无菌条件下摘取脏器组织,撕去脏器被膜,用眼科剪将脏器组织剪成小块。
2. 将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上,加入少量全血及组织稀释液(保证脏器组织及获得的细胞处于液体环境中)。
将脏器组织放置于筛网上,使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨脏器组织(尽量控制研磨力
1. 度,保持筛网悬空,避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡)
2. 研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网,收集细胞悬液,再经滤网过滤。
注:
A. 可用酶消化法,使用胶原酶对脏器组织组织进行消化,得到单细胞悬液。
B. 如果最终得到的细胞需要培养,那全过程所需试剂与器材均要求无菌。
C. 根据脏器组织的体积控制单细胞悬液的浓度在108~109个/mL。
注意事项:
A. 开封前颠倒混匀,本分离液为无菌产品,为延长分离液保存时间,请在无菌条件下启封,避免微生物污染。。
B. 分离液使用时应始终保持室温(18℃~25℃),如室内温度较低,可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心,可能会导致白膜层中红细胞污染加重。
C. 洗涤细胞,不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液,其成分会导致血细胞凝集,大大降低细胞得率及纯度。
D. 部分塑料制品(如聚苯乙烯)因其带有的静电作用,可能会导致细胞挂壁,影响分离效果。
E. 如果要进一步对分离的细胞进行培养,那在收集血液和分离过程中,注意无菌操作, 避免微生物污染。
F. 不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同,用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。
参考文献
1. Boyum A . Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968; 97: 7.
2. Ting A , Morris PJ . A technique for lymphocyte preparation from stored heparinized blood. Vox Sang. 1971 Jun; 20(6): 561-3.
3. Boyum A . Separation of Blood Leucocytes, Granulocytes and Lymphocytes Tissue Antigens. 1974; 4(4): 269-74.
5. Recalde HR . A simple method of obtaining monocytes in suspension. J Immunol Methods. 1984 Apr 13;69(1):71-7.
6. B?yumA ,L?vhaugD ,TreslandL .Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Scand J Immunol. 1991 Dec; 34(6):697-712.
7. Harris R , Ukaejiofo EO . Tissue typing using a routine one-step lymphocyte separation procedure. Br J Haematol. 1970 Feb; 18(2):229-35.
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