保存：18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后置于常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

试剂盒内容：

样本稀释液       200mL

清洗液          200mL

*组织淋巴细胞分离液      200mL

淋巴细胞分离方法

1.        制备*的单细胞悬液。

2.        取一支适当的离心管，加入与*单细胞悬液等量的分离液（分离液最少不得少于3 mL，总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果）。

3.        小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取单细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。）

4.

5.        离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。

6.        用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞至另一洁净的15mL离心管中，向离心管中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min。

7.        弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。

8.        重复步骤7

9.        弃上清，细胞重悬备用。

*单细胞悬液的制备方法

*研磨的方法：

1.        无菌条件下摘取*，撕去*被膜，用眼科剪将*剪成小块。

2.        将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液（保证*及获得的细胞处于液体环境中）。

3.        将*放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨*（尽量控制研磨力度，保持筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡）

4.        研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。

注：

A.      可用酶消化法，使用胶原酶对*组织进行消化，得到单细胞悬液。

B.       如果最终得到的细胞需要培养，那全过程所需试剂与器材均要求无菌。

C.       根据*的体积控制单细胞悬液的浓度在108~109个/mL。

注意事项：

A.      开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。

B.       分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。

C.       待分离的组织要求新鲜，避免冷冻和冷藏。

D.      部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。

如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在制备单细胞悬液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。

参考文献：

《Tumor-Repopulating Cells Induce PD-1 Expression in CD8+ T Cells by Transferring Kynurenine and AhR Activation》 作者:Yuying Liu,Xiaoyu Liang,Wenqian Dong,Yi Fang,Jiadi Lv,Tianzhen Zhang,Roland Fiskesund,Jing Xie,Jinyan Liu,Xiaonan Yin,Xun Jin,Degao Chen,Ke Tang,Jingwei Ma,Huafeng Zhang,JingYu,Jun Yan,Huaping Liang 期刊:Cancer cell  影响因子:23.916 PMID:29533786

《Improved Antitumor Efficacy of Combined Vaccine Based on the Induced HUVECs and DC-CT26 Against Colorectal Carcinoma》 作者:Qiushuang Zhang 1,?, Chao Xie 1,?, Dongyu Wang 1, Yi Yang 1, Hangfan Liu 1, Kangdong Liu 1,2, Jimin Zhao 1,2, Xinhuan Chen 1,2, Xiaoyan Zhang 1,2, Wanjing Yang 1,2, Xiang Li 1,2, Fang Tian 1,2, Ziming Dong 1,2 and Jing Lu  期刊:Cells 影响因子:5.656 PMID:31121964

《Protective Role of Peroxiredoxin I in Heat-Killed Staphylococcus Aureus-infected Mice》 作者:HU-NAN SUN,YUE LIU1,JIAN-NAN WANG, CHUANG WANG, REN LIU, LING-ZU KONG, XING ZHEN, NISANSALA CHANDIMALI, YU-DONG CUI, SUN-UK KIM, DONG-SEOK LEE, DAE-YEUL YU, JI-SU KIM, DONG KEE JEONG, TAEHO KWON6 and YING-HAO HAN1 期刊:In Vivo 影响因子:1.609 PMID:31028193

《Artificially designed hepatitis B virus core particles composed of multiple epitopes of type A and O foot‐and‐mouth disease virus as a bivalent vaccine candidate》 作者:Yao Lei, Junjun Shao,  Furong Zhao,  Yangfan Li , Chenglin Lei , Feifei Ma , Huiyun Chang , Yongguang Zhang 期刊:J. Med. Virol. 影响因子:2.049 PMID:31347713