近年来，随着病理学研究领域的不断深入，多重免疫标记技术逐步兴起。多重免疫标记技术是一种可以在同张组织样本上实现多重分子标记的免疫标记技术，配合定量分析工具，能够对组织微环境中目标分子或细胞及其相关生物标志物进行全面分析。

传统免疫荧光多重标记的基本模式是：第一抗体选择不同的种属来源，不同颜色的荧光二抗结合一抗时要满足种属匹配，区分不同种标记。

而今天小编给大家介绍的是一种基于经典HRP显色免疫标记技术的荧光多重标记检测方法，即酪酰胺信号放大（TSA）技术。TSA标记法是一项基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术，可以在细胞或组织样本原位检测多个目标靶点，通过这些靶点的组合和位置关系的研究，进而阐明其相互作用机理，对于疾病诊疗和病理诊断有着重要意义。

TSA标记法的原理

TSA技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。类似常规免疫组化的DAB显色法，TSA（Tyramide signal amplification）技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的显色底物，和DAB不同的是活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，而不是单纯的形成不溶沉淀。

之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。TSA技术是基于HRP-DAB免疫组化显色系统的优化产品，仅需添加少量试剂即可实现相邻切片单标到同切片多标的跨越式体验。原理示意图如下：

TSA操作步骤与结果

TSA技术的染色流程与经典免疫组织化学染色步骤相近，值得注意的是，依次加入一抗的过程中，额外增加了修复热处理洗脱步骤，该步骤可以将以非共价键结合在抗原上的抗体去除，但是仍然保留以共价键结合在抗原表面的TSA荧光信号，从而实现无抗体干扰的抗原直接标记，再经过多轮染色循环实现多色标记，无需考虑多种抗体之间的非特异反应。直至全部标记完成，复染DAPI后封片观察即可。

TSA标记法的优点

1. TSA标记是稳定的共价结合，荧光信号稳定，基本不受连续孵育、热修复和抗体剥离处理影响；

2. 可以使用同一种属的不同一抗搭配同一二抗使用，极大减少交叉反应对实验设计和实验结果的影响。而且可以连续染色最后观察也可逐步染色检查染色结果；

3. 搭配强力过氧化物酶封闭液能有效去除本底酶活和残留抗体对结果的影响；

4. 通过组合使用不同的TSA荧光染料，可对切片样本进行单标记放大标记到最多6重抗体标记同切片显示。

TSA标记法注意事项

1. 修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定；

2. TSA原理的多重荧光免疫组化中，由于染料是依次共价偶联在切片上的，并需要通过加热洗去前续抗体，因此需要确定染色顺序，以保证：

A. 多次加热切片不会影响后续靶点表位完整性；

B. 前续偶联的荧光素能耐受后续加热过程。

3. 多重染色需要平衡待检样品中靶点峰度和各通道信号强度。尽量做到：寡靶配强光，众靶配弱光。

4. TSA增强信号会比荧光标记二抗信号高10-100倍，能够使用更少抗体标记的同时也更容易由于抗体浓度过高造成非特异性着色。因此正式染色之前，建议先摸索各通道下每一个单抗的最佳浓度范围。

5. 鉴于多通道曝光时间较长，须使用有效抗荧光衰减封片剂封片。亦可使用含DAPI的抗荧光衰减封片剂。

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参考文献

[1] 钱帮国,焦磊.多标记免疫荧光染色及多光谱成像技术在组织学研究中的应用[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2017,26(04):373-382.

[2] Aliya U, Zaidi, Enomoto H,et al. Dual fluorescent in situ hybridizattion and immunohistochemical detection with tyramide signgal amplification.J Hisiochem Cytochem,2000,48(10):1369-1375.