小鼠P选择素ELISA 试剂盒

产品编号：SEKM-0127

适用于小鼠血清、血浆或细胞培养上清液等样本

背景介绍：
     小鼠 P-选择素(又称 CD62P、GMP-140 和 lecam-3)是白细胞粘附分子家族的一员，也包 括 E-选择素(CD62E)L-选择素(CD62l)。所有选择素都是钙依赖性受体，与白细胞表面糖蛋 白的碳水化合物结合，P-选择素储存在内皮细胞血小板和维氏栅栏体的α颗粒中。成熟的 P-选择素是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有 116 个氨基酸 N 端、C 型凝集素结构域、42 aa EGF 样结构域、8 个 60~70 aa 短串联重复序列(SCRs，又称寿司结构域)、一个 24 aa 跨膜片段和 一个短的 35 aa 胞质区。小鼠 P-选择素 EGF 样结构域与大鼠和人 P-选择素结构域的同源性 分别为 92%和 76%，与人和大鼠的同源性分别为 92%和 76%。成熟小鼠 P-选择素与 E-选择 素蛋白之间只有 35%的氨基酸序列同源性。

检测原理：
      Solarbio ELISA 试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将 抗小鼠 P-selectin 单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本， 标准品和样本中的小鼠 P-selectin 会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化 抗小鼠 P-selectin 抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的小鼠 P-selectin 发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲 和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物 TMB，若反应孔中样品存在不同 浓度的小鼠 P-selectin，则 HRP 会使无色 TMB 变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入 终止液后反应孔会变成黄色；*，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸 光度（OD），样本中的小鼠 P-selectin 浓度与 OD 成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合 软件便可计算出样本中小鼠 P-selectin 的浓度。

原理图：

注意事项：
1. 试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。
2. 试剂盒未使用时应保存在 2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。
3. 试剂盒使用前请在室温恢复 30 min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
4. 在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。
5. 为避免交叉污染，请在试验中使用 1 次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。

6. 浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶盖上，使用前请离心处理（5-10 S 即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹打几次。
7. 除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的试剂代替本试剂盒中的某单个组分。
8. 为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。

安全提示：
试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试
剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物
实验室安全防护有关管理规定执行。

自备实验器材（不提供，可代购）
1． 酶标仪（主波长 450nm，参考波长 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板机或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 双蒸水，去离子水，量筒等
6． 稀释用聚丙烯试管

样本收集及储存：
1. 细胞培养上清：
将细胞培养基移至无菌离心管，在 4℃条件下 1000 ×g 离心 10 min,然后将上清等量分装于小 EP 管于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。
2. 血清样本：
室温血液自然凝固 20 min 后，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。
3. 血浆样本：
将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择 EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 20 min ，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。
※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高
于标准品的*值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。

试剂准备：
1. 试剂回温：首先在实验前 30 min 将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入
37℃温浴直到结晶全部溶解。
2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将 20 倍浓缩洗涤液稀释成 1 倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入 4℃冰箱保存。
3. 标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml至冻干标准品中，静置15分钟待 其完全溶解后轻轻混匀(浓度为4000pg/ml)，然后按照以下浓度： 4000、2000、1000、 500、250、125、62.5、0 pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液（4000pg/ml）未用完的 应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。

4. 生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍

应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。

5. 酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将100倍浓缩酶结合物稀释成1 倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。

6. 洗涤方法： 

自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为 300ul/孔,注 与吸出间隔为 30 秒，洗板 5 次。 

手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液 300ul/孔，静止 30 秒后甩 净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板 5 次。

结果判断：

1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测，请 用 450 nm 的 OD 测定值减去 630 nm 的 OD 测定值。

2.计算标准品、样品的平均 OD 值：每个标准品和标本的 OD 值应减去零孔的 OD 值

3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中P-selectin含量可通过对应OD 值由标准曲线换算出相应的浓度。

4.若标本 OD 值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。

参数表征：

1. 数据及标准曲线

本图仅供参考，应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算小鼠 P-selectin 的样本含量

2. 灵敏度：
*可检测小鼠 P-selectin 浓度达 30pg/ml，
20 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。

3. 特异性：
不与小鼠 E-Selectin、ICAM-1、ICAM-2、L-Selectin、VCAM-1 等反应。

4. 重复性：
板内，板间变异系数<10%。

5. 回收率：
在选取的健康小鼠血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的小鼠 P-selectin，计算回收率。

6. 线性稀释：

分别在选取的 4 份健康小鼠血浆和细胞培养上清中加入高浓度小鼠 P-selectin，在标准曲线动力学范围内进行稀 释，评估线性。