莽草酸脱氢酶（SD）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
英文名称：Valeric acid dehydrogenase (SD) activity detection kit
关键词：莽草酸脱氢酶|莽草酸脱氢酶活性检测|SD|SD活性检测
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4180
规格：50T/48S

产品内容：
提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存，用前摇匀。
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 10mL 蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×2 瓶，4℃避光保存。临用前每瓶加入 11mL 蒸馏水溶解。

产品说明：
莽草酸途径是存在于植物和微生物中的一条重要的代谢途径，莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代谢途径中催化第四步反应的关键酶。
莽草酸脱氢酶催化莽草酸和 NADP 产生 NADPH，检测 340nm 下的吸光值增加速率来表示 SD 活性。

试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液（加入前摇匀））进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
液体：直接检测。

二、测定步骤：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 工作液的配制：按照试剂一：试剂二：试剂三为 7:4:8 的体积比例充分混匀，现用现配。用前25℃预热 15min。
3、 操作表：在 1mL 石英比色皿中分别加入下列试剂：
试剂名称     空白管   测定管
工作液（μL）   950      950
样本（μL）               50
蒸馏水（μL）    50

加入样本即开始计时，充分混匀后于 340nm 处测定 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值A2，计算△A 测定管= A2 测定-A1 测定，△A 空白管=A2 空白-A1 空白，△A=△A 测定管-△A 空白管。
空白管只需做一次。

三、SD 酶活计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
SD 酶活（U/mg prot）= △A÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×Crp）÷T= 643×△A÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每克样品每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
SD 酶活（U/g 鲜重）=△ A÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T = 643×△A÷W
（3）按照细胞数量计算
酶活定义：每 104个细胞每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
SD 酶活（U/104
cell）=△ A÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个））÷T
= 643×△A÷细胞数量（万个）
（4）按液体体积计算
酶活定义：每 mL 样本每分钟每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
SD 酶活（U/mL）= △A÷（ε×d）×109×V 反总÷V 样÷T= 643×△A

ε：NADPH 微摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；
d：比色皿光径，1cm；
V 反总：反应体系总体积，1×10-3L；
V 样：反应体系中样本体积，0.05mL；
Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；
W：样本质量，g，
T：反应时间：5min。

注意事项：
1、 样本提取上清液置于冰上待测，且样本提取完成后建议 2h 内测完。
2、 样品的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约 10mg/mL），所以测定样品蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
3、 △A 大于 1 时，建议将样品稀释后再进行测定。当△A 小于 0.01 时，可以延长反应时间（10min或 15min）来测定。
4、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。