肉桂醇脱氢酶（CAD）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
英文名称：Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) activity assay kit
关键词：肉桂醇脱氢酶|肉桂醇脱氢酶活性检测|CAD|CAD活性检测
货号：BC4175
规格：100T/96S

产品内容：
提取液：液体 120mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 5mL 试剂三溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 1mL 乙醇溶解，再将其全部转移至 15mL 棕色试剂瓶内（盒中提供）并再加入 14mL 乙醇混匀。溶解后 4℃保存。
试剂三：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

产品说明：
CAD 是木质素生物合成途径中的关键酶之一，催化香豆醛、芥子醛以及松柏醛等生成与之相应的肉桂醇。该酶多存在于高等植物、酵母、菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
CAD 催化肉桂醛和 NADPH 生成肉桂醇和 NADP+，在 340nm 下测定 NADPH 消耗速率，即可反映CAD 活性。

试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、乙醇和蒸馏水。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清，置冰上待测。
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104
个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤：
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。
2、 工作液的配制：将试剂一、试剂二、试剂三按 1:1:2（V:V:V）的比例配制工作液，工作液现用现配。
3、 操作表：在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入下列试剂：

试剂名称 空白管 测定管
样本（μL）        20
蒸馏水（μL）20
工作液（μL）180   180
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1，迅速置于 25℃水浴或培养箱 5min（酶标仪有控温功能可将温度调至 25℃），拿出迅速擦干测定 5min10s 时的吸光值 A2，计算△A 测定管=A1 测定-A2 测定，△A 空白管=A1 空白-A2
空白，△A=△A 测定管-△A 空白管。空白管只需做一次。

三、CAD 酶活计算：
1. 按微量石英比色皿计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD 酶活（U/mg prot）= △A÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 321.54×△A÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD 酶活（U/g 鲜重）= △A÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T=321.54×△A÷W
（3）按照细菌或细胞数量计算
酶活定义：每 104个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
CAD 酶活（U/104cell）= △A÷（ε×d）×109×V 反总÷（500×样÷V 样总）÷T
= 0.643×△A

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/ mol /cm；
d：比色皿光径，1cm；
V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；
V 样：反应体系中样本体积，0.02mL；
V 样总：加入提取液体积，1mL；
Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；
W：样本质量，g，
T：反应时间：5min；
500：细菌或细胞总数，500 万；
109：单位换算系数，1mol=109nmol。
2. 按 96 孔 UV 板计算：
将将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。

注意事项：
1、 当 A1 小于 0.8，建议将样品稀释后再进行测定。
2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.04。