3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
英文名称：3-phosphoglycerate kinase (PGK) activity assay kit
关键词：3-磷酸甘油酸激酶|3-磷酸甘油酸激酶检测|PGK|PGK检测
货号：BC2250
规格：50T/48S

产品内容：
提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2.5 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×3 支，-20℃避光保存。临用前加 1mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 10 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

产品说明：
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，引起 340nm 处的吸光度下降，即反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
血清/血浆：直接检测。

二、测定步骤：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 工作液的配制：按照蒸馏水：试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=6:10:2:1:1:4 的体积比例充分混匀，现用现配。
3、 操作表：在 1mL 石英比色皿中分别加入下列试剂：
试剂名称（μL）   空白管    测定管
工作液            900       900
样本                        100
蒸馏水            100
在 1mL 石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1，迅速置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴 5min，拿出迅速擦干测定 310s 时的吸光值A2，计算△A 测定管= A1 测定-A2 测定，△A 空白管=A1 空白-A2 空白，△A=△A 测定管-△A 空白管。
空白管只需做一次。
三、PGK 活性计算：
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（U/g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
（3）按液体体积计算：
酶活单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（U/g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷V 样÷T=321.54×ΔA÷W
（4）按细胞数量计算：
酶活单位定义：每 104个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（U/g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.643×ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，1×10-3L；
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；
d：比色皿光径，1cm；
V 样：加入样本体积，0.1mL；
V 样总：加入提取液体积，1mL；
T：反应时间，5 min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本质量，g；
500：500 万个细胞；
109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：
1. △A 大于 0.8 或者 A1 测定小于 0.9 时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当△A 小于 0.01时，可以延长反应时间（10min 或 15min）或增加样本体积来测定。
2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。
3. 样品的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约 10mg/mL），所以测定样品蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。