果糖-1,6-二磷酸（酯）酶（FBP）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
英文名称：Fructose-1,6-bisphosphatase (FBP)/fructose-1,6-diphosphatase activity assay kit
关键词：果糖-1,6-二磷酸酶|果糖-1,6-二磷酸酶检测|FBP|FBP检测
货号: BC0925
规格:100T/96S

产品简介：
果糖-1,6-二磷酸酶（Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP）又称果糖-1,6-二磷酸酯酶，其在糖异生过程和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。催化 1,6-二磷酸果糖和水生成 6-磷酸果糖和无机磷。
FBP 催化 1,6-二磷酸果糖和水，生成 6-磷酸果糖和无机磷，在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，测定 340nm 下 NADPH 的增加速率，即可计算 FBP 活性。

试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、蒸馏水。

产品内容：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 20mL 试剂四充分溶解待用，用不完的试剂于 4℃保存。
试剂二：液体 8μL×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 1.1mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：液体 108μL×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 1.1mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

操作步骤：
一、粗酶液的提取：
组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。于 4℃，8000g，离心 10min，取上清，置冰上待测。
细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min），于 4℃，8000g，离心 10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂一 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10min。
3、 操作表：(在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中依次加入下列试剂)
测定管 空白管
样本（μL）     20      -
提取液（μL）    -     20
试剂二（μL）    10    10
试剂三（μL）    10    10
试剂一（μL）    160   160
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1，迅速置于 30℃水浴或培养箱 5min（酶标仪有控温功能可将温度调至 30℃），拿出迅速擦干测定 310s 时的吸光值 A2，计算△A 测定管= A2 测定-A1 测定，△A 空白管=A2 空白-A1 空白，△A=△A测定管-△A 空白管。空白管只需做一次。
FBP 酶活性计算
1、按微量石英比色皿计算
（1）按蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
FBP（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷(Cpr×V 样) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr
（2）按样本质量计算
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
FBP（U/g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.5×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 104个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
FBP（U/104cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量（万个）) ÷T=321.5×ΔA÷细胞数量（万个）
V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；
ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；
d：比色皿光径，1cm；
V 样：加入样本体积，0.02 mL；
V 样总：加入提取液体积，1 mL；
T：反应时间，5 min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本质量，g；
109：单位换算系数，1mol=109nmol。
2、按 96 孔板计算
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm（比色皿光径）进行计算即可。

注意事项
1、 当△A 大于 0.6 时，建议将样稀释后再进行测量。
2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.02。