葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意: 正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
英文名称：Glucose-6-phosphatase activity assay kit
关键词：葡萄糖-6-磷酸酶|G6P|G6P检测
货号: BC3325
规格: 100T/48S

产品内容：
提取液：液体 120mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 12 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×2 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前用 4mL 蒸馏水溶解备用。
试剂四：试剂×1 瓶，4℃保存；临用前用 4mL 蒸馏水溶解备用。
试剂五：液体 4mL×1 瓶，4℃保存；
标准品：液体 1mL×1 支。10μmol/mL 磷标准液。

产品说明：
葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase，G6Pase，EC 3.1.3.9）是一种水解磷酸化合物的磷酸酶，广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是糖异生过程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。
G6P 催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖和无机磷，利用钼蓝法测定无机磷含量的增加，即可反映G6P 活性。

试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：
提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
二、测定步骤：
1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。
2、将 10μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释 16 倍至 0.625μmol/mL 的标准溶液备用。
3、工作液的配制：试剂二中加入 5mL 试剂一充分溶解备用。
4、定磷试剂的配制：按 H2O:试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。
若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂*用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
5、操作表：
测定管 对照管 标准管 空白管
样品（μL）          20     20
工作液（μL）        80
充分混匀，37℃（哺乳动物）或者 25℃（其他物种）水浴反应 10min。反应后迅速放入沸水中沸水浴 10min。取出冷却至常温
工作液（μL）         -     80
10000rpm 常温离心 10min 后取上清。
上清液（μL）        25     25     -      -
标准溶液（μL）      -       -     25      -
定磷试剂（μL）     125    125    125   125
蒸馏水（μL）       100    100    100   125
充分混匀，40℃反应 10min。吸取 200μL 于微量玻璃比色皿或者 96 孔板中，测量 660nm 处吸光值，测定管、对照管、空白管、标准管测定的吸光度分别记为 A 测定管、A 对照管、A 空白管、A 标准管。计算△A=A 测定管-A 对照管，△A 标准=A 标准管-A 空白管。
三、G6P 活性计算：
1、血清（浆）G6P 活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1nmol 无机磷定义为一个酶活力单位。
G6P（U/mL）=△A÷（△A 标准÷C 标准）×1000×V 酶促÷V 样品÷T=312.5×△A÷△A 标准。
2、组织、细菌或细胞中 G6P 活力计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol 无机磷定义为一个酶活力单位。
G6P（U/mg prot）=△A÷（△A 标准÷C 标准）×1000×V 酶促÷（Cpr×V 样品）÷T
=312.5×△A÷△A 标准÷Cpr。
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟生成 1nmol 无机磷定义为一个酶活力单位。
G6P（U/g 鲜重）=△A÷（△A 标准÷C 标准）×1000×V 酶促÷（W÷V 提取×V 样品）÷T=312.5×△A÷△A 标准÷W。
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1nmol 无机磷定义为一个酶活力单位。
G6P（U/104 cell）=△A÷（△A 标准÷C 标准）×1000×V 酶促÷（500÷V 提取×V 样品）÷T=0.625×△A÷△A 标准。
C 标准：标准溶液浓度，0.625μmol/mL；
V 酶促：酶促反应总体积，0.1mL；
V 样：加入样本体积，0.02 mL；
V 提取：加入提取液体积，1 mL；
T：反应时间，10min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本质量，g；
500：细菌或细胞总数，500 万；
1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol。


注意事项：
1、建议将样品用提取液稀释后再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、若 A 大于 1.5 或者显色完成后有沉淀产生，将上清液或者粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。
3、标准曲线线性范围为 0.04-5μmol/mL。
4、 定磷试剂应现配现用，正常颜色为浅黄色，如有变色或变蓝则均为失效。

相关文献：

《Hepatic c-Jun regulates glucose metabolism via FGF21 and modulates body temperature through the neural signals》 作者:FeiXiao15YajieGuo15JialiDeng1FeixiangYuan1YuzhongXiao1LijianHui2YuLi1ZhiminHu1YuncaiZhou3KaiLi3XiaoHan3QichenFang4WeipingJia4YanChen1HaoYing1QiweiZhai1ShanghaiChen1FeifanGuo 期刊:Molecular Metabolism 影响因子:6.181 PMID:30579932
《Liver-derived fibroblast growth factor 21 mediates effects of glucagon-like peptide-1 in attenuating hepatic glucose output》 作者:Junling Liu, Kun Yang, Jin Yang, Wenhua Xiao, Yunyi Le, Fei Yu, Liangbiao Gu, Shan Lang, Qing Tian, Tianru Jin, Rui Wei ,Tianpei Hong 期刊:EBioMedicine. 影响因子:6.68 PMID:30827929