产品说明：

氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是 两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG 会被谷胱甘肽还原酶还原成 GSH,因此机体中大多数是以 还原型方式存在。测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所 处的氧化还原状态。本试剂盒利用谷胱甘肽能和 5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’ -dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基 苯甲酸在波长 412nm 处具有*光吸收的特点，通过 2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型 谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。

自备仪器和用品：

分析天平、微量匀浆器（规格 2ml）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计、 Solarbio 1ml 比色皿。

一、样品的处理

1、组织处理：

新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次，然后称取动物组织或者植物组织 0.1g。加入用试剂Ⅰ润洗 过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入 1ml 试剂Ⅰ（组织/试剂Ⅰ比例保持不变 即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；10000rpm 4℃离心 10min；取上清液 放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

2、血液处理：

血浆：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体 积的试剂一, 4℃，8000g 离心 10 分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测，若暂时不能完成测 试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

血细胞：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次（用 PBS 重悬血细胞，600g 离心 10 分钟），加入等体积试剂一，混匀后 4℃放置 10 分钟，8000g 离心 10 分钟，吸取上清放于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

3、细胞处理

收集不少于 10⁸个细胞，首先用 PBS 清洗细胞 2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心 10 分钟），加 入 3 倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞，反复冻融 2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g 离心 10 分钟，收集上清于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

二、操作步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，分光光度计调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、试剂二放置 37℃（哺乳动物）或 25℃（一般物种）水浴中保温 30min。

3、标准品的稀释：将标准品用 1ml 蒸馏水溶解(4℃保存)，浓度为 1mg/ml。取适当溶液配 制浓度为 25 g/ml、20 g/ml、12.5 g/ml、6.25 g/ml、3.125 g/ml、0 g/ml 的标准 品（试剂Ⅰ十倍稀释后进行稀释）。

4、制作标准曲线 孵育完成后标准管依次加入 700μ L 试剂Ⅲ，100 μ L 试剂Ⅳ，100 μ L 试剂Ⅴ，10 μ L 试剂Ⅵ，迅速混匀后，测定 412nm 处 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2。吸光度（A2-A1）为横 坐标，浓度为纵坐标做标准曲线。

5、样品管依次加入 700μ L 试剂Ⅲ，100 μ L 试剂Ⅳ，100 μ L 试剂Ⅴ，10 μ L 试剂Ⅵ， 迅速混匀后，测定 412nm 处 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2。

三、GSH 含量计算

将样品△A（即 A2 减去 A1）带入标准曲线公式，即可计算出每 0.1g 组织或相应血液、细胞 样品中氧化型谷胱甘肽的含量。

注意事项：

1、样品处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。
2、若不确定样品中 GSSG 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。
3、此方法利用酶促反应速率计算底物浓度，尽量准确在 30 秒和 150 秒处完成读数。
4、因为试剂Ⅰ中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。
5、本试剂盒所配制的试剂除测定 48 个样品外，至少可做 4 次标准曲线。

相关文献：

《Composition Analysis by UPLC-PDA-ESI (?)-HRMS and Antioxidant Activity Using Saccharomyces cerevisiae Model of Herbal Teas and Green Teas from Hainan》 作者: Hua Li, Lanying Wang and Yanping Luo 期刊:molecules 影响因子:3.06 PMID:30301226