产品说明：

氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是 两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG 会被谷胱甘肽还原酶还原成 GSH,因此机体中大多数是以 还原型方式存在。测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所 处的氧化还原状态。本试剂盒利用谷胱甘肽能和 5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’ -dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基 苯甲酸在波长 412nm 处具有*光吸收的特点，通过 2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型 谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。

自备仪器和用品：

分析天平、微量匀浆器（规格 2ml）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计或酶标仪、 微量玻璃 比色皿或 96 孔板。

一、样品的处理

1、组织处理：

新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次，然后称取动物组织或者植物组织 0.1g。加入用试剂Ⅰ润洗 过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入 1ml 试剂Ⅰ（组织/试剂Ⅰ比例保持不变 即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；10000rpm 4℃离心 10min；取上清液 放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

2、血液处理：

血浆：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体 积的试剂一, 4℃，8000g 离心 10 分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测，若暂时不能完成测 试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

血细胞：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次（用 PBS 重悬血细胞，600g 离心 10 分钟），加入等体积试剂一，混匀后 4℃放置 10 分钟，8000g 离心 10 分钟，吸取上清放于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

3、细胞处理

收集不少于 10⁸个细胞，首先用 PBS 清洗细胞 2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心 10 分钟），加 入 3 倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞，反复冻融 2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g 离心 10 分钟，收集上清于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

二、操作步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、试剂二放置 37℃（哺乳动物）或 25℃（一般物种）水浴中保温 30min。

3、标准品的稀释：将标准品用 1ml 蒸馏水溶解(4℃保存)，浓度为 10mg/ml。取适当溶液配制浓度 为 25μg/ml、20μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、0μg/ml 的标准品（试剂一十倍稀释后进 行稀释）。

4、取 0.5ml 离心管，加入 20μL 稀释好的标准品或样品，加入 1μL 试剂二，混匀后 37℃孵育 30 分 钟。

5、制作标准曲线 孵育完成后标准管依次加入 140μL 试剂三，20 μL 试剂四，20 μL 试剂五，2 μL 试剂六，迅速混匀 后，测定 412nm 处 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2。吸光度（A2-A1）为横坐标（x），浓度为纵坐标 （y）做标准曲线。

6、样品管依次加入 140μL 试剂三，20 μL 试剂四，20 μL 试剂五，2 μL 试剂六，迅速混匀后，测定 412nm 处 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2，△A= A2- A1。

三、GSH 含量计算

根据标准曲线，将样品△A 带入公式中（x），计算出样品浓度 y（μg/ml）。
（1）按蛋白浓度计算
GSSG（μg / mg prot）=y×V 反总÷V 样÷Cpr =y×10.15÷Cpr
（2）按样本质量计算
GSSG（μg /g）= y×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)= y×10.15 ÷W
（3）按细胞数量计算
GSSG（μg /10
4 cell）= y×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)= y×10.15 ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
GSSG（μg / mL）= y×V 反总÷V 样= y×10
V 反总：反应总体积，0.203mL；V 样总：上清液总体积，1 mL；V 样：加入反应体系中上清
液体积，20μL=0.02 mL；W：样品质量，g ；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。

注意事项：

1、样品处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。
2、若不确定样品中 GSSG 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。
3、此方法利用酶促反应速率计算底物浓度，尽量准确在 30 秒和 150 秒处完成读数。
4、因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。

相关文献：

《Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin‐induced skeletal muscle injury》 作者:Ming Song , Fang‐fang Chen , Yi‐hui Li,  Lei Zhang , Feng Wang,  Ran‐ran Qin  ,Zhi‐hao Wang , Ming Zhong , Meng‐xiong Tang , Wei Zhang , Lu Han 期刊:Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle 影响因子:10.754 PMID:29152896
《Composition Analysis by UPLC-PDA-ESI (?)-HRMS and Antioxidant Activity Using Saccharomyces cerevisiae Model of Herbal Teas and Green Teas from Hainan》 作者: Hua Li, Lanying Wang and Yanping Luo 期刊:molecules 影响因子:3.06 PMID:30301226
《Cell death induced by α-terthienyl via reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the midgut of Aedes aegypti larvae》 作者:JieZhangaShakilAhmadaLan-YingWangaQianHanbJian-ChunZhangaYan-PingLuo 期刊:Free Radical Biology and Medicine 影响因子:5.657 PMID:31022448

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