产品说明：

 PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC) 催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。 PDH 催化丙酮酸脱氢，同时还原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致 605nm 光吸收的少。
需自备的仪器和用品： 

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和 蒸馏水。
操作步骤： 

一、样本的处理 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二，用冰浴匀浆器或研钵 匀浆充分研磨，4 ℃ 11000 g 离心 10min，取上清，置冰上待测。

 二、测定步骤 1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。 2、个样本需要 900μL 工作液，按样本数加一取出一定的工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其 他物种）中孵育 5min。 3、空白管：在 1mL 比色皿中加入 900 μL 工作液和 50μL 水，混匀，立即记录 605nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ?A 空白=A1-A2。 4、测定管：在 1mL 比色皿中加入 900 μL 工作液和 50μL 样本，混匀，立即记录 605nm 处初始吸 光值 A3 和 1min 后的吸光值 A4，计算?A 测定=A3-A4。 

三、PDH 活性计算

（1） 按样本蛋白浓度计算 单位的定义： mg 组织蛋白分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH 活性（U /mg prot）=[(?A 测定-?A 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T =904.762×(?A 测定-?A 空白)÷Cpr 

（2） 按样本鲜重计算 单位的定义： g 组织分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH 活性(U/g 鲜重)=[(?A 测定-?A 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T =913.81×(?A 测定-?A 空白)÷W 

（3） 按细菌或细胞密度计算 单位的定义： 1 万个细菌或细胞分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH 活性(U/104 cell)=[(?A 测定-?A 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T =1.828×(?A 测定-?A 空白) V 反总：反应体系总体积，9.5×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm； d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01 mL； T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质，g；500：细菌或细胞总数， 500 万。
注意事项： 

1、测定过程中所有样本在冰上放置，以免变性和失活。

 2、测定管的?A 值在 0.01-0.25 之间，若测定管的?A 值大于 0.25，需将样本进行稀释。

 3、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要去提取液 本身的蛋白含量。

相关文献：

《Engineering Corynebacterium glutamicum for high-titer biosynthesis of hyaluronic acid.》 作者:Fangyu Cheng,Huimin Yu,Gregory Stephanopoulos 期刊:Metab. Eng. 影响因子:7.808 PMID:31301358

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