NADP 磷酸酶（NADPase）活性检测试剂盒说明书
                                                                                       微量法
产地：北京市通州区马驹桥联东U谷85A三楼
产品商标：solarbio
注意：正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
货号: BC1115
规格:100T/48S
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            
参考价格：1180.00
库存状态：现货

产品简介：
NADPase 主要存在于植物组织中，是生物体内*催化NADP+降解为NAD+的酶，与NADK一起调控NAD 和NADP 之间的平衡。
NADPase 能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。

试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、匀浆器/研钵和蒸馏水

产品内容：
提取液：液体50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体15 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×2 支，4℃保存；用时加入1.1 mL 试剂一充分溶解备用，现配现用。
试剂三：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入8mL 双蒸水，溶解后4℃可保存一周。
试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入8mL 双蒸水，溶解后4℃可保存一周。
试剂五：液体8mL×1 瓶，室温保存。
标准品：10mmol/L 标准磷贮备液1mL×1 支，4℃保存。
1μmol/mL 标准磷应用液配制：将标准品10 倍稀释，即取1mL 标准品加9mL 蒸馏水，充分混匀备用。

定磷试剂的配制：按H2O:试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

注意：配试剂*用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
组织样品：称取约0.1g 样品，加提取液1.0 mL 充分研磨，于4℃，8000g 离心10min，取上清液置冰上待测。
二、测定步骤：
1、分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、操作表：
（1）酶促反应
试剂名称（μL）                 测定管                对照管
试剂一                                 120                    120
试剂二                                  40                       -
蒸馏水                                                           40
                 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热5min
样本                                      40                     40
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min 后，沸水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 常温离心10min，取上清。

（2）定磷
                          标准管         空白管          测定管          对照管
1μmol/mL 标准磷应用液      20
蒸馏水                                     20              
上清液                                                     20              20
定磷试剂                    200            200            200             200

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴30min，冷却至室温，吸取200μL 至微量玻璃比色皿或96 孔板总，在660nm 处记录各管吸光值，记为A 标准管、A 空白管、A 测定管、A 对照管，并计算ΔA 标准=A 标准管-A 空白管，ΔA 测定=A 测定管-A 对照管。

NADPase 酶活性计算：
1、按组织蛋白浓度计算：
定义：规定每分钟每毫克组织蛋白的组织中NADPase 分解NADP 产生1μmol 无机磷的量为一个NADPase 活力单位。
NADPase (U/mg prot) ＝ΔA 测定÷ΔA 标准÷C 标准×V 上清÷（Cpr×V 样本×V 上清÷V 酶促）÷T=0.25×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr。

2、按样本鲜重计算：
定义：规定每分钟每克组织中NADPase 分解NADP 产生1μmol 无机磷的量为一个NADPase 活力单位。
NADPase (U/g 鲜重) ＝ΔA 测定÷ΔA 标准÷C 标准×V 上清÷(W×V 样本÷V 提取×V 上清÷V 酶促)÷T=0.25×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W。
C 标准：1μmol/mL 的磷标准应用液；
V 上清：定磷试验中上清液体积，0.02mL；
Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；
V 样本：酶促反应中样本体积，0.04mL；
V 酶促：酶促反应总体积，0.2mL；
T：反应时间，20min；
V 提取：提取液体积，1mL；
W：样本鲜重，g。

注意事项：
1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，*用蒸馏水冲干净。*用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。
2、标准管、空白管只要做一次即可。