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几丁质酶活性检测试剂盒说明书
微量法

产地：北京市通州区马驹桥联东U谷85A三楼
英文名称：Chitinase activity assay kit
产品商标：solarbio
注意：正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC0825
规格：100T/48S
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            
参考价格：1300.00
库存状态：现货
关键词：几丁质酶|几丁质酶活性检测|几丁质酶检测
产品内容：
提取液：液体50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体15mL×1 瓶，4℃保存，使用前摇匀。
试剂二：液体5mL×1 瓶，4℃保存。
标准品：粉剂×1 瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。临用前加入2.27mL 蒸馏水配成10μmol/mL 的标准溶液。


产品说明：
几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物，在540nm 处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。

自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2. 真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7 s，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待检。
3. 培养液：直接测定。

二、测定操作表
1、可见分光光度计/酶标仪预热30min。波长调至540nm，蒸馏水调零。
2、将标准溶液稀释为5、4、3、2、1μmol/mL 的标准溶液备用。
3、在EP 管中分别加入：
试剂名称             测定管         对照管           标准管          空白管
样品（μL）             100            100              -               -
标准溶液（μL）          -              -               100             -
蒸馏水（μL）            -              -                -              100
试剂一（μL）           100             -               100             100
                 混匀，37℃水浴1h，沸水浴5min。
试剂一（μL）            -             100               -               -
8000rpm 常温离心10min，分别取上清液160μL 于新的EP 管中，再加入下列试剂
试剂二（μL）            40             40               40              40
混匀，沸水浴反应10min，立即置于冰上至室温。于微量玻璃比色皿或96 孔板中测定每管在540nm 下的吸光度，记为A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算ΔA 测定=A测定管-A 对照管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。

三、计算公式
1、标准曲线的绘制：
以ΔA 标准为y 轴，标准溶液浓度为x 轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。将ΔA 测定带入标准方程中，得到x（μmol/mL）
2、几丁质酶活的计算：
（1）按照样本重量计算
酶活性定义：37℃下，每g 组织每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/g 鲜重）=x×V 样÷（V 样÷V 样总×W）÷T=x÷W。
（2）按照蛋白质浓度计算
酶活性定义：37℃下，每mg 蛋白每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/mg prot）=x×V 样÷（V 样×Cpr）÷T =x÷Cpr。
（3）按照细胞数量计算
酶活性定义：37℃下，每104 个细胞每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/104 cell）=x×V 样÷（V 样÷V 样总×细胞数量）÷T =x÷细胞数量。
（4）按照培养液体积计算
酶活性定义：37℃下，每mL 培养液每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/mL）=x×V 样÷V 样÷T =x。
V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；
V 样总：加入提取液体积，1mL；
W：样本质量，g；
Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；
T：反应时间，1h；
细胞数量：以万计。

注意事项：
1、反应结束后尽快进行比色。
2、OD 值大于1.5，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数；或者缩短37℃水浴时间到X 小时（如0.5 小时），按照原先计算公式得到的结果再除以X。