产品详细描述
产品内容：
试剂一：液体100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂六：液体2.5mL×1 瓶，-20℃保存； 
产品说明：
线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ 的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。
与氧化型细胞色素C 不同，还原型细胞色素C 在550nm 有特征光吸收，因此550nm 光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 准确称取0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 将匀浆600g， 4℃离心5min。

3. 弃沉淀，将上清液转移至另一离心管中，11000g 4℃离心10min。

4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄露的复合体Ⅲ（此步可选做）。

5. 步骤（4）中的沉淀即为线粒体，加入200uL 试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3 秒，间歇10 秒，重复30 次），用于复合体Ⅲ酶活性测定。

二、测定步骤：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定

1. 工作液的配制：临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂4℃可保存一周；

（2）在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本、25μL 试剂六和200μL 工作液，立即混匀，记录550nm 处初始吸光值A1 和 2min 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
三、复合体Ⅲ 活力单位的计算：  
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样) ÷T
=615×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g 组织每分钟催化产生1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T
=124×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T
=0.248×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.35×10^-4 L；ε：细胞色素C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样) ÷T
=1230×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g 组织每分钟催化产生1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T
=248×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T
=0.496×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.35×10^-4 L；ε：细胞色素C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

相关文献：

《Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress》 作者:Liuqin He, Haiwen Zhang, and Xihong Zhou 期刊:Oxidative Medicine and Cellular Longevity 影响因子:4.868 PMID:30305866
《A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum》 作者:Qiuli OuYang, Nengguo Tao* and Miaoling Zhang 期刊:Frontier in Immunology 影响因子:4.259 PMID:29503638