线粒体转氢酶-2（TH-2）试剂盒说明书
分光光度法 50 管/48 样
正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定
产地：北京市通州区马驹桥联东U谷85A三楼
英文名称：Transhydrogenase-2 activity assay kit
产品商标：solarbio
货号: BC3260
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            
参考价格：400
库存状态：现货
关键词：转氢酶-2|转氢酶-2活性检测|转氢酶
测定意义
TH 位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互转化，调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2，催化NADPH 和NAD+生成NADP+和NADH。

测定原理
NADH 和NADPH 均在340nm 有特征吸收，因此TH 催化的转氢反应不能导致340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰pi啶腺嘌呤二核苷酸（APAD+）替代NAD+，TH-2 催化APAD+还原生成APADH，APADH 在375nm 有特征光吸收，测定375nm 光吸收的增加速率，来计算TH-2 活性。

需自备的仪器和用品
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制
试剂一：液体50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体25mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体25mL×2 瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×2 支，-20℃保存；
试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取0.1g 组织或收集500 万细菌或细胞，加入1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g，4℃离心5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-2（此步可选做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入500uL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10 秒，重复30 次），用于TH-2 活性测定。

测定步骤：
1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至375nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配制：临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用；
（2）在1mL 玻璃比色皿中加入100μL 样本和1000μL 工作液，混匀，立即记录375nm 处初始吸光值A1 和10min 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

TH-2 活性计算
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr)÷T=164×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=82×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.164×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.1×10-3L；
ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×103 L / mol /cm；
d：比色皿光径，1cm；
V 样：加入样本体积，0.1mL；
V 样总：加入提取液体积，0.5mL；
T：反应时间，10 min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本质量，g；
500：细菌或细胞总数，500 万。