单宁酶活性检测试剂盒说明书
微量法

产地：北京市通州区马驹桥联东U谷85A三楼
英文名称:
产品商标：solarbio
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4075
规格：100T/48S
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            
参考价格：1120
库存状态：现货
关键词：单宁酶活性检测|单宁酶活性测定|单宁酶|单宁酶测定
产品内容：
提取液：液体100mL×2瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2mL无水乙醇混匀溶解。
标准品：粉剂×1瓶，4℃保存。5mg 没食子酸丙酯，临用前加入1.178mL无水乙醇充分混匀溶解，配成20μmol/mL 的标准溶液。

产品说明：
单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，存在于富含单宁的植物，也广泛存在于微生物中，可以水解酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。
使用没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应的底物，其在270nn下有特征吸收峰，根据其反应前后吸光度的变化来计算单宁酶活力。

自备实验用品及仪器：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、样本处理：
（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。10000rpm 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
（2）细胞或微生物样品的制备：先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。10000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤：
（1）紫外分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至270nm。蒸馏水调零。
（2）将20μmol/mL的标准溶液用提取液稀释为0.05μmol/mL 的标准溶液，测定其在270nm下的吸光度，记为A标准。
（3）吸取0.02mL样品于1.5mLEP管中作为对照管，沸水浴5min,冷却至常温。
（4）加样表：在1.5mLEP管中分别加入
试剂名称（μL）        测定管        对照管
提取液                 170           170
试剂一                  10            10
样品                    20            20（已灭活）
40℃水浴反应10min后马上沸水浴5min，冷却后常温10000rpm离心10min，取上清。
在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂：
上清液                  10            10
提取液                  190           190
充分混匀后测定270nm下的吸光度，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A对照管-A测定管。

三、单宁酶活力计算：
1、按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。
单宁酶（U/mg prot）=ΔA÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样品×Cpr）÷T=1000×ΔA÷A标准÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。
单宁酶（U/g 鲜重）=ΔA÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样品×W÷V提取）÷T=1000×ΔA÷A标准÷W
3、按细胞或微生物个数计算：
单位的定义：每104个细胞或微生物在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。
单宁酶（U/104 cell）=ΔA÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样品×500÷V提取）÷T=1000×ΔA÷A标准

C 标准： 标准溶液的浓度， 0.05μmol/mL ；
F ： 上清液的稀释倍数， 上述反应体系中
F=200μL÷10μL=20；
1000：1μmol=1000nmol；
V样品：加入的样品体积，0.02mL；
V酶促：酶促反应总体积，0.2mL；Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；
W：样品质量，g；
V提取：提取液体积，1mL；
500：500万个细胞；
T：反应时间，10min。

注意事项：
1、如果A测定管大于1.5，可以适当加大稀释倍数，保证总体积1mL不变，如5μL上清液和195μL试剂一（相当于F=200/5=40），计算公式中需改变F和V上清液的数值。