肉桂酸-4-羟化酶（C4H）活性检测试剂盒说明书
微量法

产地：北京市通州区马驹桥联东U谷85A三楼
英文名称：Cinnamate 4-hydroxylase (C4H) activity assay kit
产品商标：solarbio
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4085
规格：100T/96S
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            
参考价格：1760
库存状态：现货
关键词：肉桂酸-4-羟化酶|肉桂酸-4-羟化酶活性检测|C5H|C5H活性检测
产品内容：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存。临用前加入2mL乙醇溶解备用。
试剂三：粉剂×2瓶，4℃保存。临用前每瓶加入2mL双蒸水充分溶解待用。现配现用。

产品说明：
C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌类中，属于细胞木质素合成途径中间的关键酶。
C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸盐和NADP，在340nm下测定NADPH的减少速率，即可反映C4H活性。

自备实验用品及仪器：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、样本处理：
（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。
（2）细胞或微生物样品的制备：先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。12000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤：
（1）紫外分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至340nm。蒸馏水调零。
（2）加样表：微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入
试剂名称（μL）       测定管
试剂一                140
试剂二                 20
试剂三                 20
样品                   20
充分混匀后立即测定10s时在340nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃水浴或37℃培养箱中3min（若酶标仪带有控温功能，将温度调为37℃）。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为A2。计算ΔA=A1-A2。

三、C4H活力计算：
1、按微量石英比色皿计算：
（1） 按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
C4H（U/mg prot）=[ΔA÷(ε×d)×109×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =535.91×ΔA÷Cpr。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
C4H（U/g 鲜重）=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反总]÷(W÷V提取×V样)÷T =535.91×ΔA÷W。
（3） 按细胞或微生物个数计算：
单位的定义：每104个细胞或微生物在反应体系中每分钟减少1nmolNADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
C4H（U/104 cell）=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反总]÷(500÷V提取×V样)÷T =1.072×ΔA。

V反总：反应总体积，2×10-4L；
ε：NADPH的摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；
d：比色皿光径，1cm；
V样：加入的样品体积，0.02mL；
Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；
W：样品质量，g；
V提取：提取液体积，1mL；
500：500万个细胞；
T：反应时间，3min。
2、按96孔UV板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可

注意事项：
1、当ΔA大于0.4时，建议将样品用提取液稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间（5min或10min）或增加加入的样品体积来测定。