酪氨酸酶活性检测试剂盒说明书
微量法

产地：北京市通州区马驹桥联东U谷85A三楼
英文名称：Tyrosinase activity assay kit
产品商标：solarbio
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4055
规格：100T/96S
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            
参考价格：760
库存状态：现货
关键词：酪氨酸酶活性检测|酪氨酸酶活性|酪氨酸酶
产品内容：
提取液：液体125mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×3瓶，4℃保存。临用前每瓶加入7mL提取液充分溶解待用。现配现用。

产品说明：
酪氨酸酶（tyrosinase：EC1.14.18.1）是一种单酚单加氧酶，是具有双功能的含铜糖蛋白，广泛存在于植物、酵母和动物组织中。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶，也是引起果蔬酶促褐变的主要因素，同时也对昆虫的免疫及生长有重要影响酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素，其在475nm下有特征吸收峰，进而测定出酪氨酸酶的活性。

自备实验用品及仪器：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：
一、样本处理：
（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
（2）细胞或微生物样品的制备：先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。12000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
（3）血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤：
（1）分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至475nm。蒸馏水调零。
（2）加样表：
在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入
试剂名称（μL）    测定管
试剂一              180
样品                 20
充分混匀后立即测定10s时在475nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱中3min（若酶标仪自带控温功能，将温度调至37℃或25℃）。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为A2。计算ΔA=A2-A1。

三、酪氨酸酶活力计算：
1、按微量玻璃比色皿计算：
(1) 按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。
酪氨酸酶（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T =90.09×ΔA÷Cpr。
(2) 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。
酪氨酸酶（U/g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(W÷V提取×V样)÷T =90.09×ΔA÷W。
(3) 按细胞或微生物个数计算：
单位的定义：每104个细胞或微生物每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。
酪氨酸酶（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(500÷V提取×V样)÷T =0.18×ΔA。
(4) 按样品体积计算：
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。
酪氨酸酶（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷V样÷T =90.09×ΔA。

V反总：反应总体积，2×10-4L；
ε：多巴色素的摩尔消光系数：3.7×104 L/mol/cm；
d：比色皿光径，1cm；
109：1 mol=109 nmol；
V样：加入的样品体积，0.02mL；
Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；
W：样品质量，g；
V提取：提取液体积，1mL；
500：500万个细胞；
T：反应时间，3min。
2、按96孔板计算将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm 进行计算即可。

注意事项：
1、当分光光度计ΔA大于0.3或酶标仪ΔA大于0.2时，建议将样品用提取液稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间（5min或10min）或增加加入的样品体积来测定。
2、试剂一溶解后易氧化。溶解后尽快用完。