花青素还原酶（ANR）活性检测试剂盒说明书
微量法

产地：北京市通州区马驹桥联东U谷85A三楼
英文名称：Anthocyanin Reductase (ANR) Activity Assay Kit
产品商标：solarbio
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4095
规格：100T/48S
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            
参考价格：5600
库存状态：现货
关键词：花青素还原酶|花青素还原酶活性检测|ANR|ANR活性检测
产品内容：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。临用前摇晃均匀。
试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×2支，4℃保存。每支临用前加入1mL蒸馏水备用。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前加入1mL乙醇和1mL蒸馏水混匀溶解备用。可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四：液体1mL×1支，4℃保存。

产品说明：
花青素还原酶（ANR）是原花青素生物合成途径中的关键酶，使花色素转变为相应的顺式黄烷-3-醇，在植物体内起着非常重要的调控作用。
ANR在NADPH作用下将氯化矢车菊素转化为黄烷-3-醇和NADP，在340nm下测定NADPH的减少速率，即可反映ANR活性。

自备实验用品及仪器：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、样本处理：
（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。
（2）细胞或微生物样品的制备：先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。12000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤：
（1）紫外分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至340nm。蒸馏水调零。
（2）加样表：
试剂名称（μL）      测定管       对照管
试剂一                170          170
试剂二                10            10
试剂三                 5             5
样品                   10            -
上述试剂混匀后37℃水浴反应30min。
试剂四                  5            5
样品                    -            10
混匀后测量测定管和对照管在340nm下的吸光度，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A对照管-A测定管。

三、ANR活力计算：
1、按微量石英比色皿计算：
（1） 按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
ANR（U/mg prot）=[ΔA÷(ε×d)×109×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =107.18×ΔA÷Cpr。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
ANR（U/g 鲜重）=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反总]÷(W÷V提取×V样)÷T =107.18×ΔA÷W。
（3） 按细胞或微生物个数计算：
单位的定义：每104个细胞或微生物在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
ANR（U/104 cell）=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反总]÷(500÷V提取×V样)÷T =0.2144×ΔA。

V反总：反应总体积，2×10-4L；
ε：NADPH的摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；
d：比色皿光径，1cm；
V样：加入的样品体积，0.01mL；
Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；
W：样品质量，g；
V提取：提取液体积，1mL；
500：500万个细胞；
T：反应时间，30min。
2、按96孔UV板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。

注意事项：
1、当ΔA大于0.4或者A对照管大于1（96孔UV板为ΔA大于0.2或者A对照管大于1）时，建议将反应混合液用试剂一稀释更大倍数或者减少加入的样品体积进行测定；ΔA过小时，可以增加酶促反应时间（45min或60min）或增加加入的样品体积来测定。
2、加入试剂四后，请在15min内测定完成。
3、样品蛋白浓度另行测定。