吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法

产地：北京市通州区马驹桥联东U谷85A三楼
英文名称：Indoleacetic acid oxidase activity detection kit
产品商标：solarbio
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4100
规格：50T/24S
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            
参考价格：680
库存状态：现货
关键词：吲哚乙酸氧化酶|吲哚乙酸氧化酶活性检测|吲哚乙酸氧化酶活性
产品内容：
提取液：液体40mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水备用。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入3mL蒸馏水备用。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前加入5.71mL 50%乙醇（乙醇（V）：H2O（V）=1：1）溶解备用。可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入30mL试剂四溶解备用。
标准品：粉剂×1支，-20℃保存，10mg 吲哚乙酸。临用前加入1.14mL 50%乙醇（乙醇（V）：H2O（V）=1：1）溶解制成50μmol/mL的标准溶液。可分装后-20℃保存。

产品说明：
吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。IAA氧化酶能调节植物体内吲哚乙酸的的水平，从而影响植物的生长。
IAA在无机酸条件下与FeCl3作用生成红色产物，在530nm下有*吸收峰。酶活力的大小可用破坏IAA的速率表示。

自备实验用品及仪器：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

测定操作：
1、样本处理：
（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。
（2）细胞或微生物样品的制备：先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。12000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
2、操作步骤：
（1）可见分光光度计预热30min，波长调至530nm。蒸馏水调零。
（2）将标准溶液用蒸馏水稀释为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 μmol/mL的标准液。
（3）加样表：
试剂名称（μL）     测定管     对照管      标准管     空白管
提取液               200        200         -           -
试剂一                40         40         -           -
试剂二                40         40         -           -
试剂三                80           80         -            -
样品                  40            -         -            -
上述试剂混匀后30℃水浴反应30min。- -
试剂四               400           400       400          400
样品                  -             40         -            -
标准品                -              -        400           -
蒸馏水                -              -         -           400
10000g 常温离心10min，取上清液。- -
上清液               750            750        -             -
标准品混合液                                  750           750
试剂五               400            400       400           400
30℃避光放置30min，之后分别测量530nm处的吸光值，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管，计算ΔA=A对照管-A测定管，ΔA标准=A标准管-A空白管。

IAA氧化酶活力计算：
1、标准曲线的绘制：
以标准液的浓度为x轴，对应的ΔA标准为y轴绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程中计算得x（μmol/mL）
2、IAA氧化酶活力计算：
（1） 按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol IAA的酶量定义为一个酶活性单位。
IAA氧化酶（U/mg prot）=x×V酶促×1000÷(V样×Cpr)÷T=333×x÷Cpr。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol IAA的酶量定义为一个酶活性单位。
IAA氧化酶U/g 鲜重）= x×V酶促×1000÷(W÷V提取×V样)÷T =333×ΔA÷W。
（3） 按细胞或微生物个数计算：
单位的定义：每104个细胞或微生物在反应体系中每分钟消耗1nmol IAA的酶量定义为一个酶活性单位。
IAA氧化酶（U/104 cell）= x×V酶促×1000÷(500÷V提取×V样)÷T =0.667×ΔA。

V酶促：酶促反应总体积，0.4mL；
1000:1μmol=1nmol；
V样：加入的样品体积，0.04mL；
Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；
W：样品质量，g；
V提取：提取液体积，1mL；
500：500万个细胞；
T：反应时间，30min。

注意事项：
1、当ΔA大于0.5或者A对照管大于1时，建议将样品用提取液稀释后进行测定；ΔA过小时，可增加酶促反应时间（1h或2h）或增加加入的样品体积来测定。
2、试剂一溶解变黑后则不能使用；试剂二有毒性，做好防护措施。